2016-06-01
隨著三代測序技術(shù)的成熟，得到了越來越多的科研工作者的認(rèn)可。關(guān)于三代測序的文章數(shù)量，近年來不斷地增長，很多發(fā)表在SCI的期刊上，比如利用三代測序技術(shù)開展轉(zhuǎn)錄組測序，可獲得mRNA的全長信息和基因結(jié)構(gòu)信息，這類研究的文章影響因子基本是10分以上。說到這里，各位老師、學(xué)者們是不是已經(jīng)按耐不住了呢？今天小編就三代轉(zhuǎn)錄組測序的技術(shù)原理帶領(lǐng)大家縱觀全長轉(zhuǎn)錄組的時代！三代測序又稱單分子實時測序技術(shù)（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指對 DNA 分子進(jìn)行測序時，不需要經(jīng)過擴(kuò)增，實現(xiàn)對每一條 DNA 分子進(jìn)行單獨(dú)測序的技術(shù)。將三代測序應(yīng)用在轉(zhuǎn)錄組測序中，可以真實反映動植物基因組結(jié)構(gòu)信息，獲得全長轉(zhuǎn)錄組。眾所周知，應(yīng)用二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，無論是有參考基因組還是無參考基因組，都需要拼接成一個完整的轉(zhuǎn)錄本，那么問題來了，二代測序下機(jī)的都是短片段，要得到原始的轉(zhuǎn)錄本信息，就需要對短片段進(jìn)行拼接。通過PacBio所獨(dú)有的環(huán)形一致性測序（Circular-consensus sequence，CCS）模式，可以極大地提高測序的準(zhǔn)確率，一般而言，將序列循環(huán)測序5~6次后，獲得的一致性序列的準(zhǔn)確率可以達(dá)到99.99%（QV40）以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了二代測序的準(zhǔn)確率。
【平臺較量】
加利福尼亞太平洋生物科學(xué)公司（Pacific Biosciences of California, Inc., PacBio）推出的三代測序平臺主要有兩大系列，即 RS 系列和 Sequel 系列。其中，RS II 系列于2013年4月份推出，通量為 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系列于2015年9月份推出，該系列與 RS II 系列測序原理相同，但測序通量有了很大的提升，單個 SMRT Cell 的測序通量為 RS II 系列的 7 倍。目前，國內(nèi)應(yīng)用廣泛的仍然是 RS II 系列。但是小編所在的公司派森諾生物已經(jīng)訂購了一臺 Sequel。以下表格就是兩大系列的對比：
【二代、三代建庫流程較量】
而對于建庫來說三代也比二代的建庫分外簡單，具體流程對比如下圖所示：
圖1 三代轉(zhuǎn)錄組測序建庫流程
圖2 二代轉(zhuǎn)錄組測序建庫流程
從建庫流程我們也可以看到，無需磁珠富集mRNA，三代轉(zhuǎn)錄組測序只要用隨機(jī)引物將RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，再通過將cDNA跑E膠選擇目的片度（如3K-5K），切膠回收后再進(jìn)行一輪擴(kuò)增、加環(huán)狀接頭后形成CCS，即可上機(jī)。（其中環(huán)狀接頭序列為
5’ – pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT – 3’ ：前面綠色和后面藍(lán)色反向互補(bǔ)，形成配對，中間序列成環(huán)，整個形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。）一個文庫對應(yīng)一個SMRT Cell，單個 SMRT Cell 的運(yùn)行時間為 2~6 h，每個SMRT Cell有15萬個零模波導(dǎo)孔（ZMWs），不同片段長度的文庫進(jìn)入孔的效率不同，一般小片段文庫進(jìn)入孔的效率高；由于三代測序過程中無需擴(kuò)增，因而避免了測序覆蓋的不均一性，也沒有GC 偏好性。
【全長轉(zhuǎn)錄組測序小結(jié)】
綜上所述，基于三代測序平臺RS II 和Sequel，技術(shù)上我們省時又省力，不論是RNA的總量（≥1μg）還是建庫步驟，較二代的測序的流程都簡明了很多；其次，我們可以得到轉(zhuǎn)錄組目標(biāo)片段的全長以及轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量等信息，解決了擴(kuò)增cDNA序列3‘或5’端的技術(shù)難題。目前關(guān)于三代測序的文章數(shù)量不斷地增長，連同二代測序一起研究的文章也是不勝枚舉，下一期我們就針對具體的文獻(xiàn)，結(jié)合三代的分析再跟大家一起分享！
