【引言】
小編在剛接觸三代測(cè)序時(shí)，深深地被它的超長(zhǎng)讀長(zhǎng)所吸引，非常興奮。這種興奮沒(méi)持續(xù)多久，原因是小編是一個(gè)技術(shù)控，大腦中馬上跳出一連串的疑問(wèn)（相信各位讀者也存在類(lèi)似的疑問(wèn)）：三代測(cè)序的單堿基準(zhǔn)確率很低，用這么低準(zhǔn)確率的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接拿到的結(jié)果靠不靠譜？三代測(cè)序的拼接算法不成熟，我拿到三代數(shù)據(jù)怎么拼？三代測(cè)序的成本很高，我能承受得起嗎？后來(lái)，隨著小編對(duì)三代測(cè)序的深入了解，發(fā)現(xiàn)我擔(dān)憂的這些都不是事！不是事！不是事！
接下來(lái)，小編就來(lái)給大家普及一下三代測(cè)序的基本知識(shí)。
【何為三代測(cè)序？】
三代測(cè)序又稱單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指對(duì) DNA 分子進(jìn)行測(cè)序時(shí)，不需要經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)每一條 DNA 分子進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序的技術(shù)。
【三代測(cè)序的技術(shù)陣營(yíng)？】
三代測(cè)序根據(jù)其技術(shù)原理主要分為兩大陣營(yíng)，基于單分子熒光信號(hào)及基于納米孔電流信號(hào)進(jìn)行測(cè)序，代表公司分別為 Pacific Biosciences 和Oxford Nanopore。目前，Pacific Biosciences 公司推出的三代測(cè)序儀在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)接受度和應(yīng)用廣泛。
【PacBio 為何能實(shí)現(xiàn)單分子超長(zhǎng)測(cè)序？】
PacBio的單分子超長(zhǎng)讀長(zhǎng)主要?dú)w功于兩項(xiàng)重大發(fā)明專利技術(shù)：
其一：零模波導(dǎo)孔技術(shù)（Zero-Mode Waveguides，ZMWs）。該專利的設(shè)計(jì)靈感來(lái)自于微波爐門(mén)，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是設(shè)計(jì)一個(gè)孔徑非常小的納米孔，光僅能照亮固定了單個(gè) DNA 聚合酶/模板分子的納米孔底部。該發(fā)明專利能.大限度地降低背景熒光信號(hào)噪音，使單分子的熒光信號(hào)檢測(cè)成為可能；
其二：核苷酸標(biāo)記方法。傳統(tǒng)的一代、二代測(cè)序均是將熒光標(biāo)記連接到核苷酸的堿基上，也就是摻入到 DNA 鏈中。這些大分子的熒光染料影響 DNA 聚合酶的活性，造成聚合反應(yīng)的提前終止。PacBio 的熒光標(biāo)記連接到核苷酸的磷酸基團(tuán)，熒光標(biāo)記會(huì)隨著 DNA 鏈的延伸而自動(dòng)脫落，所形成的 DNA 分子為天然的 DNA 鏈。
【PacBio 測(cè)序平臺(tái)？】
PacBio 公司推出的三代測(cè)序平臺(tái)主要有兩大系列，即 RS 系列和 Sequel 系列。其中，RS II 系列于2013年4月份推出，通量為 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系列于2015年9月份推出，該系列與 RS II 系列測(cè)序原理相同，但測(cè)序通量有了很大的提升，單個(gè) SMRT Cell 的測(cè)序通量為 RS II 系列的 7 倍。目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用.為廣泛的仍然是 RS II 系列。但是，據(jù)小編所知，很多公司都在積極引進(jìn) Sequel 測(cè)序系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)訂購(gòu)的 Sequel 系統(tǒng)數(shù)量已經(jīng)接近 10臺(tái)。小編所在的公司派森諾生物也已經(jīng)訂購(gòu)了一臺(tái) Sequel，該平臺(tái)預(yù)計(jì)會(huì)在 5 月份發(fā)貨，6月份進(jìn)行裝機(jī)。
【PacBio 測(cè)序優(yōu)勢(shì)？】
1、超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，平均 Reads 長(zhǎng)度超過(guò) 20 kb，.長(zhǎng)讀長(zhǎng)超過(guò) 60 kb；
2、無(wú)需經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，避免測(cè)序覆蓋的不均一性；
3、無(wú) GC 偏好性；
4、測(cè)序速度快，單個(gè) SMRT Cell 的運(yùn)行時(shí)間為 2~6 hr；
5、直接獲得堿基的修飾信息，如甲基化修飾；
6、一致性準(zhǔn)確率高，30× 的測(cè)序深度拼接得到的單堿基一致性準(zhǔn)確率可達(dá)到99.999%。
【PacBio 測(cè)序模式及其應(yīng)用？】
三代測(cè)序模式主要有兩種，即標(biāo)準(zhǔn)模式和環(huán)形一致性測(cè)序模式（circular-consensus sequence，CCS），這兩種模式的目的及應(yīng)用范圍均不同。
標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序模式的主要目的是為了獲得長(zhǎng)片段序列，主要應(yīng)用于基因組從頭測(cè)序、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序等；
CCS測(cè)序模式的主要目的是為了獲得稀有突變信息，主要應(yīng)用于16S 宏基因組測(cè)序、低頻率的異質(zhì)性序列獲取等等。
