2016-08-12
派森諾生物與上海海洋大學水產資源開發與利用重點實驗室共同合作，在《PLOS ONE》發表論文，首次揭示了草魚抵抗嗜水氣單胞菌感染的免疫應答機制。
1. 研究背景
草魚（Ctenopharyngodon idella），又名鯇魚、草鯇、烏青、混子，棲息于平原地區的江河湖泊。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發性致病菌。長期以來，草魚對嗜水氣單胞菌較易感，感染個體有較高的死亡率，給漁業資源造成較大的經濟損失。嗜水氣單胞菌入侵魚體后，先在腸道內增殖，再經門動脈循環進入肝臟、腎臟及其它組織，引起肝臟、腎臟等器官以及血液病變，繼而出現全身癥狀。那么，嗜水氣單胞菌感染草魚后，草魚機體的免疫系統是怎樣做出應答反應的，基因轉錄組水平的相關研究還很少。
2. 研究目的
RNA-Seq研究表明多種魚類如娃娃魚、青海湖裸魚、大菱鲆等遭嗜水氣單胞菌侵染后，與免疫應答相關的結構和功能基因表達發生了顯著變化。為了研究嗜水氣單胞菌感染草魚后，草魚體內的免疫應答機制，中國海洋大學水產資源開發與利用重點實驗室的黨云飛等對感染前后不同時間段的草魚脾臟組織進行了轉錄組測序。
3. 研究方法
本研究草魚樣本采自江蘇吳江國家農場，飼養在用高錳酸鉀滅菌的循環水體中，每天飼喂三次。實驗組草魚腹膜內注射100ul 2.7 × 107 CFU/mL嗜水氣單胞菌，對照組草魚注射相同體積的PBS。實驗組草魚注射嗜水氣單胞菌后4, 8, 12, 24, 48 和72 h分別取魚的脾臟組織，并立即用液氮速凍，保存在-80℃冰箱。后續對每個樣本分別提取總RNA進行建庫測序。
4. 分析內容與結果說明
4.1序列拼接與unigene功能注釋
通過RNA-seq無參轉錄組數據分析，序列拼接共得到52,668 unigenes，平均長度為1,072bp，具體拼接結果見表1。
表1 序列拼接結果
圖1 草魚unigene E-value分布圖
4.2 Unigene功能注釋
將拼接得到的所有unigenes 與NR數據庫比對，并對其進行GO, eggNOG, KEGG功能注釋，結果顯示unigene主要分布在“cytoplasm” (9,944)，“plasma membrane” (4,144)，“cytosol” (3,726)等功能，具體注釋結果見表2，圖2。
表2 Unigene注釋結果
圖2 草魚unigene GO功能注釋（A）和eggNOG功能注釋（B）
4.3 草魚轉錄本進化保守性分析
為了評估草魚unigene序列的保守性，用BlastX方法將草魚序列與其他五種模式魚（斑馬魚、河豚、棘魚、青鳉和鲀）數據庫進行比較，結果顯示有38,910 (73.88%) unigenes共同存在于五種魚類中，結果見圖3。
圖3 草魚unigene保守性分析
4.4 基因表達差異分析
將實驗組4, 8, 12, 24, 48 和72 h的測序結果分別與對照組0 h進行基因表達差異分析，6個比較組共得到2,992 DEGs。這些DEGs共參與39個通路，其中參與免疫系統相關通路的有89個DEGs。從圖4中可以看出，“complement and coagulation cascades” 補體系統是較多DEGs參與的通路，說明草魚在遭嗜水氣單胞菌感染后，補體成分在免疫應答中發揮著重要作用。
圖4 差異基因參與的免疫相關通路
4.5 補體系統相關DEGs qPCR驗證
為了進一步驗證草魚在感染嗜水氣單胞菌后天然免疫系統相關DEGs的表達量變化，研究者共挑選了18個DEGs進行了qPCR實驗，圖5是部分qPCR驗證結果。結果顯示微管蛋白（TUBB）和組織蛋白酶S(CTSS)在感染后4-12 h顯著上調；還有一些與補體通路相關的基因如MARCO、CHMP5、MHCI的表達量也出現明顯上調，并且與轉錄組測序的結果一致。
圖5 qPCR驗證
5. 研究結論
人工養殖條件下的草魚病害較多，提高草魚抗病力是增加養殖產量的重要途徑之一。由嗜水氣單胞菌感染引起的魚類疾病給漁業生產造成了嚴重危害，本研究通過第二代高通量測序技術在轉錄組水平上揭示了草魚機體抵抗病菌感染的天然免疫應答反應，為進一步研究免疫相關基因之間的網絡調控關系提供了有利數據。同時，也為更好的進行草魚飼養提供了幫助。
6. 原文索引
Dang Y, Xu X, Shen Y, et al. Transcriptome Analysis of the Innate Immunity-Related Complement System in Spleen Tissue of Ctenopharyngodon idella Infected with Aeromonas hydrophila.[J]. Plos One, 2016, 11(7).
