2016-08-23
在上一期的“5分鐘小課堂”中，小編梳理了宏基因組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟流程，并概述了挖掘宏基因組學(xué)大數(shù)據(jù)的四大“法寶”：拼接組裝、功能注釋、生物標(biāo)記物篩選和菌株水平的精細(xì)解析。其中，首當(dāng)其沖的就是宏基因組的拼接組裝，可謂高通量測序中的“拼圖游戲”。作為后續(xù)三大“法寶”的數(shù)據(jù)來源，拼接組裝的效果將直接影響下游分析的可靠性，對研究意義的重要性不言而喻。今天，就讓小編與您一起，探索宏基因組拼圖游戲的奧秘，獻(xiàn)上史上最全攻略！
1. 什么是拼接？
拼接組裝是根據(jù)序列的一致性，將高通量測序產(chǎn)生的眾多宏基因組DNA短片段依次有序地重疊連接在一起，從而“重建”獲得較長的連續(xù)不間斷序列，也就是傳說中的“Contigs”。利用雙端PE（Paired-end）序列攜帶的信息，可以估計Contigs之間的間隔長度（即Gaps），從而連接形成Scaffolds。
宏基因組的拼接組裝流程圖，修改自文獻(xiàn)[1]
通過以上介紹，小伙伴們有沒有發(fā)現(xiàn)，宏基因組拼接組裝和拼圖游戲真的有異曲同工之妙呢！這里，拼圖的原材料就是短片段序列，拼出的圖就是Contigs和Scaffolds，而游戲的通關(guān)秘訣，無疑就是選取合適的拼接組裝算法啦！
2. “拼圖游戲”的關(guān)鍵：de Bruijn圖和一筆畫問題
宏基因組包含成千上萬種微生物，彼此之間的含量差異可達(dá)好幾個數(shù)量級。拼接組裝這樣的“大雜燴”，不僅需要龐大的數(shù)據(jù)量，更需要選取精巧、合適的算法。
目前的宏基因組大數(shù)據(jù)通常由Illumina HiSeq測序儀產(chǎn)生，序列較短（2 × 150 bp）但通量極高。因此，科學(xué)家對序列拼接組裝的算法做了針對性的優(yōu)化，將拼圖游戲簡化為我們熟知的“一筆畫問題”圖論問題，下圖就是個鮮活生動的例子：
基于de Bruijn圖的序列拼接組裝示意圖，修改自文獻(xiàn)[2]
上圖中，原始序列長度為4堿基。首先將每一條短序列都拆分為一系列長度為k的子片段（俗稱k-mer），比如，圖中的原始序列AAGA被拆分為AAG和AGA兩個長度為3堿基的k-mer。然后根據(jù)全體k-mer之間的連接順序和重疊關(guān)系構(gòu)建de Bruijn圖，嘗試找到一次性遍歷所有k-mer的“一筆畫”路徑，由此完成拼接組裝，獲得Contigs和Scaffolds序列（圖中的紅色部分為重復(fù)序列，可以看到，它們也被正確識別和拼接）。
3. 常用拼接組裝工具簡介
目前，基于de Bruijn圖的序列拼接組裝工具已成為主流，包括SOAPdenovo2[3]和IDBA-UD（Iterative De Bruijn graph Assembler for sequencing data with highly Uneven Depth）[4]等。這些工具都能對原始序列中隱含的測序錯誤進(jìn)行校正，從而提升拼接組裝的精確度。通常而言，SOAPdenovo2的拼接速度較快，而IDBA-UD采用了迭代算法，從一系列k-mer值中，選取最合適的k-mer參數(shù)進(jìn)行拼接組裝，同時針對宏基因組中不同物種測序深度不均一的現(xiàn)象進(jìn)行了優(yōu)化，因而被認(rèn)為更適合于宏基因組的拼接組裝。
IDBA-UD拼接組裝流程圖，修改自文獻(xiàn)[4]
當(dāng)然，de Bruijn圖也并非萬能。對于最近日漸流行的三代單分子實時測序技術(shù)，由于其具有超長讀長的特性，HGAP（Hierarchical Genome Assembly Process）[5]等根據(jù)序列比對尋找彼此之間重疊區(qū)域的方法更為合理。
4. 拼接效果的評價
正如游戲得分有高低，在拼接完成后，我們也需要對組裝效果進(jìn)行評估。顯然，Contigs和Scaffolds長度是評價的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。通常我們使用N50值來評估，將所有Contigs/Scaffolds序列按照長度從長到短依次排列后相加，當(dāng)加和的長度達(dá)到總長度的50%時，最后一條Contigs/Scaffolds序列的對應(yīng)長度即N50值。顯然N50越長，拼接組裝效果越好，宏基因組序列也就越完整。
N50值計算示意圖
當(dāng)然，宏基因組的復(fù)雜程度將直接影響拼接組裝的效果。比如，對于腸道宏基因組樣本，迄今為止的幾項大型研究（如MetaHIT、HMP和IGC等項目）得到的基因目錄的N50值都在1 kb左右[6-8]。
結(jié)語
通過以上的講解，小伙伴們對宏基因組的“拼圖游戲”應(yīng)該入門了吧！總體而言，拼圖游戲雖然復(fù)雜，但只要選對合適的算法，通關(guān)也并非遙不可及！當(dāng)然，隨著科技的不斷發(fā)展，我們也期待涌現(xiàn)更多更強大的宏基因組拼接組裝工具。
至于拼接獲得的Contigs/Scaffolds序列如何用于后續(xù)分析，且待下回分解，敬請各位小伙伴保持關(guān)注哦！
附：【5分鐘小課堂】后續(xù)預(yù)告
l 看不見摸不著的它們，都在忙些啥？宏基因組功能注釋為您解答！
l 茫茫菌群，誰是天使，誰是元兇，誰又是圍觀路人甲？
l 菌株水平的超高分辨率解析，宏基因組學(xué)就是這么高大上！
參考文獻(xiàn)
1. Fan W, Li RQ (2012) Test driving genome assemblers. Nature Biotechnology 30: 330-331.
2. Berger B, Peng J, Singh M (2013) Computational solutions for omics data. Nature Reviews Genetics 14: 333-346.
3. Luo RB, Liu BH, Xie YL, Li ZY, Huang WH, et al. (2012) SOAPdenovo2: an empirically improved memory-efficient short-read de novo assembler. GigaScience 1: 6.
4. Peng Y, Leung HCM, Yiu SM, Chin FYL (2012) IDBA-UD: a de novo assembler for single-cell and metagenomic sequencing data with highly uneven depth. Bioinformatics 28: 1420-1428.
5. Chin CS, Alexander DH, Marks P, Klammer AA, Drake J, et al. (2013) Nonhybrid, finished microbial genome assemblies from long-read SMRT sequencing data. Nat Methods 10: 563-569.
6. Huttenhower C, Gevers D, Knight R, Abubucker S, Badger JH, et al. (2012) Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486: 207-214.
7. Li JH, Jia HJ, Cai XH, Zhong HZ, Feng Q, et al. (2014) An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome. Nature Biotechnology 32: 834-841.
8. Qin JJ, Li RQ, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, et al. (2010) A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464: 59-65.
