2016-08-25
派森諾生物與武漢水產研究所、華中農業大學共同合作，在《Fish & Shell?sh Immunology》（影響因子3.025）發表論文，對感染和未感染柱狀黃桿菌的鱖魚的頭腎組織樣本進行測序，探討免疫相關基因的作用，為防治柱形病提供新思路。
一、研究背景
柱狀黃桿菌(Flavobacterium cloumnare)為柱形病的病原菌，魚類被感染后的主要表現包括魚鰭破損、爛鰓和表皮潰瘍，對水產業造成嚴重經濟損失。鱖魚是亞洲國家重要的經濟魚類，近年來鱖魚柱形病發病率明顯增加。本文探討鱖魚被柱狀黃桿菌侵染后的基因表達調控機制，為防治柱形病提供分子基礎。
二、材料
選取5月齡鱖魚，平均體重68.5±12.1 g， 置于25-26℃淡水循環的系統里喂養。柱狀黃桿菌在Shieh培養基培養，收集，濃度調整到5×108CFU/ml。
隨機選取六條鱖魚，腹腔注射137 ml 柱狀黃桿菌，對照組則注射等體積的Shieh培養基。36小時后當注射柱狀黃桿菌的魚游動行為出現異常，立即取頭腎組織并凍在液氮中。提取樣本的總RNA，構建文庫，利用Illumina HiSeq平臺上機測序，并進行數據分析。
三、結果
1.感染組和未感染組間的差異表達基因及GO、KEGG富集分析
分析差異表達基因軟件為DESeq，使用表達倍數差異和p-value篩選標準，結果得到1019個差異基因，包括603個上調基因和416個下調基因。
圖1 差異基因的火山圖和MA圖
圖2 表達差異基因的GO富集分析
圖3 表達差異基因的KEGG富集分析
2.分析與免疫反應相關的差異的基因
在差異表達基因中找到27個與免疫相關的基因，包括17個上調基因和10個下調基因，這27個免疫相關基因的序列已被證實并列入NCBI基因數據庫。
3.qPCR驗證差異表達基因
為驗證轉錄組測序的結果，隨機挑選6個基因用于qPCR驗證，兩種實驗模式下上下調的趨勢一致。
圖4 qPCR驗證結果
四、討論：
由于實驗樣本的鱖魚頭腎組織為免疫器官，下面針對17個上調和10個下調的免疫反應相關基因進行具體討論。
1.細胞因子相關基因
細胞因子由大量的細胞產生，在免疫應答和造血系統中扮演重要角色。細胞因子綁定到特定的靶細胞的膜受體，觸發信號轉導通路，最終改變靶細胞的基因表達。
2.補體系統
補體系統是一個非常重要的先天免疫系統的一部分，它補充抗體和吞噬細胞清除受感染的生物的病原體。結果中3個補體因子是表達上調，包括C8α 和 C6β，表明感染FC的鱖魚中經典的和備選的補體旁路均被激活，補體通路激活的細節還需在未來深入研究。
3.細胞凋亡
細胞凋亡是一個無處不在的過程，涉及到許多蛋白質和重要的是宿主清除病原體。結果中，細胞色素C (Cyt C) 和 CASP3表達上調，而熱休克蛋白70(Hsp70)則表達下調，Cyt C和CASP3可以促進細胞凋亡。
4.激酶
感染FC后的鱖魚中有兩個激酶(AMPK和ZAP-70)表達下調，AMPK在細胞能量平衡中發揮作用，包括刺激脂肪酸氧化和抑制脂肪生成；ZAP-70是T細胞受體的一部分，在T細胞激活中扮演重要角色，隨后促進T細胞分化、增殖和細胞因子分泌。而兩個激酶下調的機制還需再研究。
5.鐵代謝
值得注意的是，感染FC后的鱖魚中鐵調素的表達是未感染組的126倍，是免疫相關基因中差異最明顯的。鐵調素是由25-84個氨基酸構成的短肽，主要由肝臟產生，具有殺菌的性能，已有研究證明炎癥狀態下鐵調素水平會升高。可見鐵離子的調節是預防細菌感染的重要策略。
6.細胞信號蛋白激酶
細胞信號是調節細胞活動和協調細胞行為的一個復雜的基本通信系統。鈣調蛋白(CaM)是一個小的、高度保守的蛋白質，通過結合鈣離子能傳感信號。SHC-轉化細胞表面受體的蛋白質傳輸信號，如表皮生長因子受體(EGFR)和胰島素受體。14-3-3蛋白是一類在所有真核細胞中表達的保守的調控分子，可以結合多種功能不同的信號蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受體。鱖魚感染FC以后SHC2表達下調，而Ca Ml-6 和 14-3-3表達上調，意味著處理組和對照組之間復雜的相關性。
參考文獻
Zhou W, et al. Analysis of the transcriptomic profilings of Mandarin fish (Siniperca chuatsi) infected with Flavobacterium columnare with an emphasis on immune responses. Fish & shellfish immunology 43(1):111-119.
