2017-11-17
三代單分子測序一個十分重要的優勢是能夠同時獲得基因組中的甲基化修飾信息。當基因組中某位點存在堿基修飾時，測序速度會變慢，Pacbio公司得出檢測算法，可以識別m6A、m5C和m4C的甲基化修飾。近年來，甲基化研究熱度居高不下。在細菌基因組中，N6-甲基腺嘌呤（m6A）和N4-甲基胞嘧啶（m4C）很常見，它們作為限制修飾（RM）系統的一部分行使重要功能。三代單分子實時（SMRT）測序技術的出現，為甲基化位點的定位提供了簡單高效的方法，事實上，三代測序所能提供的甲基化信息遠比我們想象中豐富。
分子生物學經典雜志《Nucleic Acids Research》（影響因子10.162）中刊登了一篇文章，通過對12株結核分枝桿菌（MTBC）進行三代測序，深度挖掘“精確甲基化”信息。
研究方法：
借助SMRT測序技術和二代亞硫酸氫鹽甲基化測序，鑒定屬于不同MTBC譜系的12種MTBC菌株的甲基化位點。通過數據庫比對和分子生物學實驗鑒定了3個m6A序列motif及其相應的MTase基因。此外，通過計算“The methylated-motif-site ratio”和“The methylated-read ratio”，研究每個甲基化修飾位點的甲基化狀態和序列讀取，獲得MTBC菌株的精確甲基化信息。
測序平臺：PacBio RS II&Illumina HiSeq
研究結果：
1、MTBC菌株全基因組甲基化狀態（12株）
對12株菌基于三代數據進行甲基化分析，共找到3個甲基化motif。表格中統計的Motif數量包括在正鏈和負鏈上的甲基化數目，結果中可以看出，并非所有的motif序列都是被修飾的。
2、未甲基化motif在基因區(GR)和基因間區(IGR)區域的分布
研究人員總結了未甲基化motif在基因組當中的分布情況，表中括號中的數字表示半甲基化（一條鏈被甲基化）。結果顯示，有相當比例的GATN4TAC未甲基化位點分布在IGR中，它們大多位于起始密碼子上游50bp，而大多數的激活子位于起始密碼子上游70~80bp處，因此這些位點保持未甲基化狀態可能是為了保證有關基因順利轉錄。
3、甲基化reads比例
以SMRT測序reads為研究對象定義公式：甲基化reads比例（The methylated-read ratio）=甲基化reads數/包含motif的reads數，結果如表中所示。由此定義了MTBC菌株的“精確甲基化”，“精確的甲基化”顯示在具有活性MTase的MTBC菌株中存在未甲基化的基序位點。
4、MTase基因預測及MTase基因中的SNP/Indel位點分布
在REBASE數據庫中比對預測得到MTBC菌株中3個有活性的甲基化基因——mamA、mamB、hsdM，并進行了分子生物學的鑒定。由于突變/缺失，MTase活性在12個菌株之間變化。通過檢測MTase基因中的SNP/Indel位點分布觀察到，大多數未修飾的位點與轉錄因子結合區重疊，可能保護了這些位點免受甲基化。
結論
使用SMRT測序技術，鑒定屬于不同MTBC譜系的12種MTBC菌株的甲基化位點，以及3個m6A序列motif及其相應的MTase基因。此外，研究人員還通過計算“The methylated-motif-site ratio”和“The methylated-read ratio”，研究每個甲基化修飾位點的甲基化狀態和序列讀取，以獲得MTBC菌株的精確甲基化信息，同時使MTase的復雜活性能夠在全基因組測序中被分析。
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文章索引
Lingxiang Zhu, Jun Zhong, Xinmiao Jia, et al. Precision methylome characterization of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) using PacBio single-molecule real-time (SMRT) technology.Nucleic Acids Research,Jan 29;44(2):730-43
閱讀原文鏈接：https://dx.doi.org/10.1093%2Fnar%2Fgkv1498
