2016-09-08
隨著三代測序技術的成熟，得到了越來越多的科研工作者的認可。關于三代測序的文章數量，近年來不斷地增長，很多發表在SCI的頂級期刊上，比如利用三代測序技術開展轉錄組測序，可獲得mRNA的全長信息和基因結構信息，這類研究的文章影響因子基本是10分以上。說到這里，各位老師、學者們是不是已經按耐不住了呢？
今天小編就三代轉錄組測序的技術原理帶領大家縱觀全長轉錄組的時代！三代測序又稱單分子實時測序技術（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指對 DNA 分子進行測序時，不需要經過擴增，實現對每一條 DNA 分子進行單獨測序的技術。將三代測序應用在轉錄組測序中，可以真實反映動植物基因組結構信息，獲得全長轉錄組。
眾所周知，應用二代轉錄組測序技術，無論是有參考基因組還是無參考基因組，都需要拼接成一個完整的轉錄本，那么問題來了，二代測序下機的都是短片段，要得到原始的轉錄本信息，就需要對短片段進行拼接。通過PacBio所獨有的環形一致性測序（Circular-consensus sequence，CCS）模式，可以極大地提高測序的準確率，一般而言，將序列循環測序5~6次后，獲得的一致性序列的準確率可以達到99.99%（QV40）以上，遠遠超過了二代測序的準確率。
平臺較量
加利福尼亞太平洋生物科學公司（Pacific Biosciences of California, Inc., PacBio）推出的三代測序平臺主要有兩大系列，即 RS 系列和 Sequel 系列。其中，RS II 系列于2013年4月份推出，通量為 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系列于2015年9月份推出，該系列與 RS II 系列測序原理相同，但測序通量有了很大的提升，單個 SMRT Cell 的測序通量為 RS II 系列的 7 倍。目前，國內應用最為廣泛的仍然是 RS II 系列。但是小編所在的公司派森諾生物已經訂購了一臺 Sequel。以下表格就是兩大系列的對比：
二代、三代建庫流程較量
而對于建庫來說，三代也比二代分外簡單，具體流程對比如下圖所示：
圖1 三代轉錄組測序建庫流程
圖2 二代轉錄組測序建庫流程
從建庫流程我們也可以看到，無需磁珠富集mRNA，三代轉錄組測序只要用隨機引物將RNA樣品進行反轉錄形成cDNA，再通過將cDNA跑E膠選擇目的片度（如3K-5K），切膠回收后再進行一輪擴增、加環狀接頭后形成CCS，即可上機。（其中環狀接頭序列為5’–pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT– 3’前面綠色和后面藍色反向互補，形成配對，中間序列成環，整個形成發卡結構。）一個文庫對應一個SMRT Cell，單個 SMRT Cell 的運行時間為 2~6 h，每個SMRT Cell有15萬個零模波導孔（ZMWs），不同片段長度的文庫進入孔的效率不同，一般小片段文庫進入孔的效率高；由于三代測序過程中無需擴增，因而避免了測序覆蓋的不均一性，也沒有GC 偏好性。
全長轉錄組測序小結
綜上所述，基于三代測序平臺RS II 和Sequel，技術上我們省時又省力，不論是RNA的總量（≥1μg）還是建庫步驟，較二代的測序的流程都簡明了很多；其次，我們可以得到轉錄組目標片段的全長以及轉錄本的表達量等信息，解決了擴增cDNA序列3‘或5’端的技術難題。目前關于三代測序的文章數量不斷地增長，連同二代測序一起研究的文章也是不勝枚舉，下一期我們就針對具體的文獻，結合三代的分析再跟大家一起分享！
