2016-09-12
派森諾生物與上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院、復旦大學生態(tài)與進化生物學系共同合作，在《BMC Microbiology》上發(fā)表論文，對天然冬蟲夏草的內(nèi)生菌群及其關聯(lián)微環(huán)境進行了系統(tǒng)研究。
研究背景：
Ophiocordyceps sinensis （中文名叫冬蟲夏草，DCXC），是一種由寄生真菌和蟲共同構成的復合體，它具有地域偏好性，主要分布于西藏及周邊省份的藏族自治區(qū)。作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，從天然蟲草中提取的生物活性成分具有廣泛的藥理作用，比如抗炎癥、抗氧化、抗癌、較低血糖、抗細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)以及保肝保腎。由于天然蟲草的超高藥用價值，導致它被過度開采，瀕臨滅絕。在過去數(shù)十年里，科學家們致力于天然蟲草內(nèi)源真菌的分離鑒定，但僅通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法分析過有限數(shù)量的蟲草個體。隨著高通量測序技術的飛速發(fā)展普及，全面研究天然蟲草的菌群組成、結構和功能活性迫在眉睫。
研究目的：
本研究對天然蟲草進行分子普查，揭示其群落的組成、結構和功能活性，為天然蟲草的遺傳多樣性及功能探究奠定基礎，并為保護稀有的天然蟲草提供可持續(xù)發(fā)展的生物技術模型。
研究方法：
本研究從3個取樣位點分別采集5—10個天然蟲草，獲得子座（Stroma）和菌核（Sclerotia）兩個內(nèi)生菌群樣本，以及外部皮層菌絲體（External mycelial cortices）和周邊土壤（Soil）兩個關聯(lián)微環(huán)境樣本，通過Roche 454 FLX+焦磷酸測序技術，分別對細菌16S rRNA基因的V1-V3可變區(qū)和真菌的ITS區(qū)序列進行測序分析。
圖1 天然蟲草樣本采集信息
分析內(nèi)容與結果說明：
1.蟲草內(nèi)生菌群和關聯(lián)微環(huán)境的多樣性比較
在本研究中，通過對16S rRNA基因和ITS區(qū)的焦磷酸高通量測序，總獲得44,588條細菌16S rRNA V1-V3可變區(qū)序列和51,584條真菌ITS區(qū)序列，在97%的序列相似度下，分別歸并得到14,975和9427個OTU。有意思的是，外部皮層菌絲體和周邊土壤兩個微環(huán)境中的微生物多樣性，遠遠高于蟲草自身（子座和菌核）的多樣性。
表1 天然蟲草內(nèi)生菌群和關聯(lián)微環(huán)境的多樣性統(tǒng)計表
2.菌群類型不同，組成結構大相庭徑
將細菌和真菌群落分別與SILVA和UNITE數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn)，在門水平的細菌群落中，Proteobacteria是最優(yōu)勢群落，在子座、菌核、外部皮層菌絲體和周邊土壤中，分別占68.4%、49.5%、38.9%和35.6%；真菌群落中，Ascomycota最為優(yōu)勢，在上述四個菌群中，分別占21.0%、45.6%、26.4%和59.3%。 在屬水平的細菌群落中，Pseudomonas（9.24%）和Rhodoferax（9.11%）在菌核中最為優(yōu)勢，Pedobacter (8.05%)和Rhodoferax (6.91%)的豐度在子座中占據(jù)前兩位，而外部皮層菌絲體中豐度最高的是Thermomonas (3.43%)和Gemmatimonas (2.13%)，周邊土壤樣本中豐度最高的是Ferruginibacter (3.07%)和Gemmatimonas (2.22%)。
真菌群落中，Entoloma在菌核（2.62%）和外部皮層菌絲體（3.47%）中最為優(yōu)勢。在子座中，Exophiala (2.90%)、Cladophialophora (1.77%)和Phaeomollisia (1.45%)最為優(yōu)勢，而在土壤中，Cladophialophora (3.30%)和Verrucaria (3.10%)的豐度高居前兩位。
圖2 四個類型的細菌和真菌菌群在門水平的組成
3.不同類型群落間的相似性
通過PCoA主坐標分析進一步發(fā)現(xiàn)，周邊土壤和外部皮層菌絲體中的細菌群落更為相似，并與子座和菌核群落差異明顯。對于真菌群落而言，菌核和外部皮層菌絲體之間的菌群結構則更為相似。
圖3 細菌與真菌群落的主坐標分析（PCoA）
4.樣品中細菌與真菌總豐度的定量驗證
最后，研究人員通過熒光定量PCR的方法，比較了不同菌群類型中細菌和真菌群落總量的高低。T檢驗表明，真菌群落的總量顯著高于細菌群落（P<0.05），同時，土壤群落中細菌和真菌的總量均顯著高于其它類型的菌群（P<0.05）。
圖4 不同類型的菌群中細菌和真菌總量的比較分析
研究結論：
本研究通過454焦磷酸高通量測序的方法，對天然蟲草內(nèi)生菌群及其關聯(lián)微生境的微生物組成結構和多樣性進行了全面系統(tǒng)的研究，從而揭示了天然蟲草不同類型菌群中的本質(zhì)差異，并為從微生態(tài)學角度解釋天然蟲草的具有超高藥用價值提供了依據(jù)。也為自然界中具有生物活性和潛在藥用價值的其它天然物質(zhì)提供了應用新思路。
原文索引：
Fei Xia, Yan Liu, Meng-Yuan Guo, Guang-Rong Shen, Juan Lin2 and Xuan-Wei Zhou. Pyrosequencing analysis revealed complex endogenetic microorganism community from natural DongChong XiaCao and its microhabitat. BMC Microbiology (2016) 16:196;doi10.1186/s12866-016-0813-5
