2017-12-14
微衛星DNA（Microstatellite），又稱簡單重復序列（Simple Sequence Repeat, SSR），指基因組中由1-6個核苷酸組成的串聯重復序列，廣泛分布在各種真核生物基因組中。微衛星DNA的兩端一般是比較保守的單拷貝序列，據此可設計特異引物進行PCR擴增。根據串聯重復數不同，可以揭示微衛星DNA長度的多態性，而具有長度多態性的片段可用作分子標記。微衛星標記因具有多態性豐富、分布廣泛、遺傳共顯性等優點廣泛應用于遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種、種質資源鑒定、遺傳多樣性研究等領域。
微衛星標記開發的方法有很多，主要可分為以下三類：（1）利用數據庫/相關文獻進行搜索和查找；（2）近緣物種間引物交叉擴增；（3）從gDNA、cDNA、EST中篩選微衛星位點。隨著高通量測序技術的不斷發展，其在微衛星領域中的應用也越來越廣泛。通過高通量測序進行的微衛星標記開發方法主要有：（1）基因組測序（genomic SSR）；（2）轉錄組測序（EST-SSR）；（3）SSR文庫富集測序。本文列舉了幾種常用的基于高通量測序的微衛星DNA開發方法及相應的文章解析，下面就讓小編帶領大家共同一探究竟吧！
1. 基于富集文庫測序的微衛星DNA開發方法
文章題目：High-throughput microsatellite isolation through 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing of enriched DNA libraries
發表期刊：Mol Ecol Resour 2011.02 IF: 7.332
研究背景：
無參物種由于沒有可用的基因組信息以及重復序列從頭組裝困難等問題的困擾，使得其微衛星標記的開發和利用存在一定的限制。目前，微衛星標記的開發多采用鳥槍法測序技術進行。然而，由于隨機測序的SSR分離效率較低，數據浪費問題比較嚴重。故該研究報道了一種將SSR文庫富集技術與焦磷酸測序有效結合的微衛星DNA分離方法。
研究方法：
基因組DNA超聲或酶切打斷后，利用8種生物素標記的探針雜交捕獲SSR序列，將文庫富集后進行測序，測序平臺為454 GS-FLX。該方法首先在模式生物意大利蜜蜂中進行流程優化，然后在其它13個物種（含動植物和真菌）中驗證和評估有效性。
研究結果：
在所試驗物種中共獲得11497-34483條序列，微衛星位點數量從199至5791不等。研究結果表明，富集文庫測序能夠有效提高微衛星分離效率，與不富集相比效率提高約300%。同時減少不需要的motif類型及比例（如AT motif由于難擴增很少用于基因分型）。因此，該方法能夠成功應用于許多非模式物種的微衛星標記開發，且和傳統方法相比，能夠有效節約成本。
2. 簡化基因組測序開發新的亞麻SSR分子標記
文章題目：Development of Novel SSR Markers for Flax (Linum usitatissimum L.) Using Reduced-Representation Genome Sequencing
發表期刊：Fronts Plant Sci 2017.01 IF: 4.298
研究背景：
亞麻是一種重要的纖維和油料作物，開發亞麻的分子標記對于提高亞麻產量和改善亞麻質量具有重要意義。目前，RAPD、AFLP和ISSR等方法已被用于亞麻分子標記的開發，但這些方法既耗時耗力，又不能獲得較好的重復性。
研究方法：
采用簡化基因組進行測序，測序數據量為2G，測序平臺為Illumina HiSeq 2000 （2*100bp），利用SOAPdenovo組裝后mapping到亞麻參考基因組。利用MISA軟件對二至六堿基核苷酸重復的SSR進行搜索；利用Primer Premier軟件進行引物設計。
研究結果：
在亞麻基因組中共鑒定到1720個SSR位點，其中有1574個SSRs是新發現的。SSRs motif類型主要以三堿基重復（56.1%）和二堿基重復（35.23%）為主（表1）。
表1 不同類型SSR motif的頻率
采用62對引物對中國東北部的48種亞麻進行多態性鑒定，發現他們主要分為纖維用亞麻和油用亞麻兩類（圖1）。值得注意的是，在纖維用亞麻中，栽培種“NEW1”和“Venus”的遺傳背景顯著不同。類似地，“A0529”的遺傳背景也不同于其他油用亞麻。因此，這三個亞麻栽培種對亞麻育種來說具有重要意義。
圖1 基于SSR分子標記的亞麻遺傳多樣性分析
3. 毛花獼猴桃的轉錄組微衛星標記開發和應用
文章題目：Development and Application of Transcriptome-Derived Microsatellites in Actinidia eriantha (Actinidiaceae)
發表期刊：Fronts Plant Sci 2017.08 IF: 4.298
研究背景：
毛花獼猴桃是一種原產于中國的多年生二倍體木本植物，由于維生素C含量高且具有藥用價值，被視為重要的商業獼猴桃品種。表達序列標簽SSRs（EST-SSRs）不僅能揭示物種的適應性和環境的異質性，而且由于有較高的保守性，在不同物種間（同屬內）也表現出較好的可轉移性。
研究方法：
對來自4個野生群體的8個毛花獼猴桃的果實進行轉錄組測序以開發微衛星標記，測序平臺為Illumina MiSeq。并用其中一個個體驗證擴增特異性，用來自7個群體的186個個體進行遺傳多樣性和遺傳結構研究。
研究結果：
通過轉錄組測序和從頭組裝產生69783個非冗余的功能基因，在7495個功能基因中共鑒定到8658個EST-SSR位點，利用183對引物進行PCR擴增，結果顯示，有69個位點具有多態性，且其中61個位點能在至少一個物種中擴增成功（圖2）。隨機挑選14個位點進行遺傳多樣性分析，進化樹和貝葉斯群體結構結果顯示樣本分為2個明顯獨立的亞群，與這些樣本的地理分布一致（圖3）。因此，該研究結果對于毛花獼猴桃遺傳多樣性的研究具有一定的指導意義。
圖2 毛花獼猴桃功能基因注釋及EST-SSRs的開發流程
圖3 基于14個EST-SSRs的毛花獼猴桃進化樹構建及群體結構分析
