2016-11-01
很多時候，我們更希望知道菌群行使的具體功能，也就是解釋“它們在干什么？”。對菌群進行宏基因組測序自然是解決方案，但如此高大上的研究方法，投入成本相對較多，分析方法也相對復雜。如果僅僅知道菌群組成，該怎么把物種的“身份”和它的“功能”對應起來呢？
由此，一款名為PICRUSt的菌群代謝功能預測利器應運而生，相關論文發表在權威期刊《Nature Biotechnology》上[1]。PICRUSt全稱為“Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States”，可以通過16S rRNA基因序列，預測對應的細菌和古菌的代謝功能譜。
有了PICRUSt，相當于在菌群的“組成”和“功能”之間搭起了一座橋，即使只有16S rRNA基因的測序結果，我們一樣可以獲得宏基因組級別的研究結果！
1 PICRUSt的基本原理
PICRUSt的總體思路說來很簡單，主要分為3步：
1. 先根據已測微生物基因組的16S rRNA基因全長序列，推斷它們的共同祖先的基因功能譜；
2. 對Greengenes數據庫中其它未測物種的基因功能譜進行推斷，構建古菌和細菌域全譜系的基因功能預測譜；
3. 最后，將測序得到的菌群組成“映射”到數據庫中，對菌群代謝功能進行預測。該步驟具體通過以下方式實現：
i. 對測序獲得的16S rRNA基因序列，進行“封閉式”參考OTU劃分（Closed-reference OTU picking），通過與Greengenes數據庫比對，尋找每一條測序序列的“參考序列最近鄰居”，并歸為參考OTU；
ii. 根據“參考序列最近鄰居”的rRNA基因拷貝數，對獲得的OTU豐度矩陣進行校正；
iii. 根據“參考序列最近鄰居”對應的KEGG/EggNOG等基因功能譜數據，換算預測菌群的整體代謝功能。
PICRUSt分析的基本流程圖示【1】
2 PICRUSt的特點
PICRUSt算法的一大特點，就是基于Greengenes的16S rRNA基因全長序列數據庫，對菌群測序結果進行“封閉式”參考OTU劃分。PICRUSt開發者對古菌和細菌域的大多數模式微生物的功能進行預測，讓人欣喜的是，絕大多數的微生物預測結果與真實的基因功能譜非常接近（古菌預測精確度為0.94 ± 0.04，n = 103；細菌為0.95 ± 0.05，n = 2487）。也就是說，絕大多數情況下，PICRUSt的預測效果還是相當靠譜滴！
PICRUSt對細菌/古菌基因組預測的精確度
當然，若測序序列與Greengenes數據庫中沒有同源物種的參考序列，則對應的物種將無法被預測。也就是說，原始數據在分析過程中會有一定損失。此外，PICRUSt的特點也表明，它只能對已知微生物的已知功能進行功能預測，所以目前并不能完全代替宏基因組研究，但可以看作宏基因組研究的“近似”結果，在經費、資源有限的情況下，不失為一種理想的選擇。
3 PICRUSt的應用
在小編看來，PICRUSt對于菌群研究的貢獻大大滴！首先，PICRUSt能從菌群組成數據解讀潛在的功能，可謂充分發揮了16S rRNA基因測序簡單、快速、物美價廉的優勢；其次，PICRUSt對菌群功能的預測，可以幫助指導后續宏基因組De novo鳥槍法測序的實驗設計，更合理地篩選用于后續研究的樣本。
同時，PICRUSt分析的操作相當便捷，只需對測序數據進行“封閉式”參考OTU劃分，并將得到的OTU豐度矩陣上傳至Galaxy在線分析平臺（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=PICRUSt_normalize），按提示操作就能得到預測結果啦！
PICRUSt在線分析平臺
4 16S+PICRUSt，研究新趨勢
PICRUSt這一方法橫空出世后，已有越來越多的研究開始采用這一方法預測菌群組成數據，相關論文發表數量逐年增長，表明該方法已得到大家廣泛的認可。16S+PICRUSt，已成為發表高水平論文的技能；同時與宏基因組分析相比，更方便快捷，成本也更低，何樂而不為！
采用PICRUSt方法的菌群研究文獻逐年增長
比如，今年發表在微生態學旗艦期刊《The ISME Journal》（影響因子9.328）的一篇論文《Cigarette smoking and the oral microbiome in a large study of American adults》[2]中，作者就通過PICRUSt預測了吸煙人群和未吸煙人群的口腔菌群，發現共有83個基因功能代謝通路存在顯著差異，吸煙大大降低了碳水化合物和能量代謝、異型生物質降解等代謝通路的含量。
PICRUSt對吸煙人群口腔菌群的功能預測[2]
結語
經過上面的講解，大家是不是感受到了PICRUSt預測菌群功能的強大威力了呢？小編在這里想說，PICRUSt雖然厲害，但并不是萬能，一方面由于它是基于16S rRNA基因的參考序列庫，因此尚無法對真菌群落進行功能預測，而預測過程也會造成原始數據的部分損失，對于不同來源的菌群的預測效果也有所差異（一般對于人源微生物組的預測效果最好）；同時，它并不能完全代替宏基因組研究（目前只能對已知微生物的已知功能進行功能預測），但可以對后續實驗設計作出指導。
參考文獻
1. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, et al. (2013) Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 31: 814-+.
2. Wu J, Peters BA, Dominianni C, Zhang Y, Pei Z, et al. (2016) Cigarette smoking and the oral microbiome in a large study of American adults. ISME J 10.1038/ismej.2016.37.
