派森諾生物與華東理工大學(xué)合作，應(yīng)用宏基因組學(xué)的方法，挖掘棉花降解中新的糖苷水解酶代謝路徑，其研究成果于2016年發(fā)表于《Journal of Biotechnology》上（最新影響因子：2.667）。
1 研究背景
糖苷水解酶是水解酶家族中的一大類，隸屬于糖基酶，是所有可水解糖苷鍵的酶類總稱。近年來(lái)，隨著糖類物質(zhì)在生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的重要性越發(fā)凸顯，關(guān)于糖苷酶的研究與應(yīng)用也變得越發(fā)重要。在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，需要更高性能的糖苷水解酶，以便使生物質(zhì)原料有效的降解為可發(fā)酵糖類。本文通過(guò)宏基因組學(xué)方法結(jié)合基因克隆、蛋白表達(dá)等手段，挖掘土壤微生物群落中，可以提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和生物制品生產(chǎn)的新的生物質(zhì)降解酶。
2 研究方法
樣本來(lái)源：棉花種植地土壤樣本
測(cè)序平臺(tái)：Illumina MiSeq+HiSeq
首先通過(guò)MiSeq平臺(tái)分別測(cè)序細(xì)菌16S V4區(qū)以及真菌ITS1區(qū)，獲取樣本中相應(yīng)的菌群組成多樣性及豐度等信息；然后利用HiSeq平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行宏基因組鳥槍法測(cè)序，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)獲得相應(yīng)糖苷水解酶信息；最后通過(guò)基因克隆，蛋白表達(dá)以及酶活性測(cè)定等方式挖掘新的糖苷水解酶。
3 研究結(jié)果
3.1 土壤微生物群落組成分析
MiSeq平臺(tái)共產(chǎn)出57,883 條序列，根據(jù)97%相似度閾值歸并劃分出214個(gè)OTU，并發(fā)現(xiàn)在門水平優(yōu)勢(shì)菌群為Proteobacteria（72%）、Bacteroidetes（17%）、Firmicutes（10%），其中Proteobacteria中以Gamma-Proteobacteria（41%）與Beta-Proteobacteria（26.1%）為主；Bacteroidetes中以Cytophagales（14.3%）為主；Firmicutes中以Bacillus（9.99%）為主。
利用MetaPhlAn構(gòu)建菌群結(jié)構(gòu)分類等級(jí)樹，以不同顏色區(qū)分各分類單元，并通過(guò)節(jié)點(diǎn)大小反映它們的豐度分布情況，從復(fù)雜的群落數(shù)據(jù)中快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)的微生物類群
3.2 宏基因組數(shù)據(jù)分析
HiSeq平臺(tái)共產(chǎn)出3.3Gb宏基因組數(shù)據(jù)，拼接組裝后的Contigs數(shù)據(jù)提交到MG-RAST進(jìn)行分析；共406,305條序列通過(guò)質(zhì)量控制，并預(yù)測(cè)得到321,789個(gè)蛋白編碼區(qū)進(jìn)行后續(xù)分析；將這些蛋白通過(guò)BLASTX在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定了32個(gè)最主要的糖苷水解酶類家族成員，包含2058個(gè)候選基因，其中豐度最高的三個(gè)家族為GH2、GH3以及GH43，并最終從這些基因中挑選24個(gè)作為克隆及蛋白表達(dá)分析。
32個(gè)最主要的糖苷水解酶家族，共包含2058個(gè)候選基因
3.3 糖苷水解酶基因的克隆表達(dá)及特性研究
被選定的糖苷水解酶基因通過(guò)PCR擴(kuò)增及克隆到表達(dá)載體的方式引入到大腸桿菌等宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)，并對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后續(xù)進(jìn)行酶活性檢測(cè)；最終挑選出16個(gè)在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化及生物制品生產(chǎn)中存在潛在應(yīng)用價(jià)值的糖苷水解酶基因克隆。
對(duì)于1GH_75-2，1GH_49以及1GH_368酶的最適溫度和pH調(diào)查
4 研究結(jié)論
本研究描述了從棉花種植地土壤中鑒定的微生物群落參與粗棉生物降解的功能特性，通過(guò)宏基因組學(xué)的研究方法結(jié)合基因克隆、蛋白表達(dá)及酶活性測(cè)定等手段，成功篩選出16個(gè)在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化及生物制品生產(chǎn)存在潛在應(yīng)用價(jià)值的糖苷水解酶類基因，為研究生物質(zhì)降解酶并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際提供了理論基礎(chǔ)與研究思路。
參考文獻(xiàn)
Zhang G, Liu P, Zhang L, et al. Bioprospecting metagenomics of a microbial community on cotton degradation: Mining for new glycoside hydrolases[J]. Journal of Biotechnology, 2016, 234:35-42.
