2024-11-21
今天，小派介紹一下兩位表觀組學的?？?Chip-seq與ATAC-seq，盡管這兩種技術在測序流程和數據處理方面具有諸多共性，比如都涉及基因組mapping，peak calling，peak注釋，差異peak分析，motif分析等步驟，并且它們常與其他組學技術如 RNA-seq 結合，以揭示蛋白質調控基因機制。但兩者在研究目標和實際應用方面有明顯差異。小派這就來跟大家分享一下他們的技術原理，以及在那些高分文章中他們是怎么大展拳腳的。文尾小派還整理了表觀遺傳研究高分文章常見實驗技術和聯用示例哦~。
一．首先我們初步了解一下ATAC-seq和Chip-seq
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）是一種高通量測序技術，旨在研究基因組中開放染色質區域。該方法能夠快速、靈敏地識別出基因組上哪些區域的染色質結構較為松散，從而使得DNA更容易被蛋白質因子如轉錄因子結合。
ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）是一種高通量測序技術，專門用于研究蛋白質與DNA之間的相互作用，能夠精確地識別特定蛋白質，例如轉錄因子和組蛋白，在基因組中的結合位點。
如果想進一步了解ATAC-seq和Chip-seq的實驗原理以及分析結果上的差別，趕緊看看咱們往期詳細講解的軟文哦！
CHIP-Seq的10問10答（點擊查看）
一次過癮，你想要的ATAC這里都有（點擊查看）
二．ATAC-seq和ChIP-seq到底有啥區別？
Chip-seq是實驗前明確有一個感興趣的轉錄因子，根據目標轉錄因子設計抗體去做Chip-seq實驗拉DNA，驗證感興趣的轉錄因子是否與DNA存在相互作用；而ATAC-Seq一般用于不知道特定的轉錄因子，是在全基因組范圍內檢測染色質的開放程度，可以得到全基因組范圍內的蛋白質可能結合的位點信息，用這個技術方法與其他方法結合是想去篩感興趣的調控因子。
三．那有沒有必要兩個組學測序都做呢？兩者是否需要聯用？
Chip-seq和ATAC-seq分別用于研究蛋白質-DNA相互作用和開放染色質區域，然而，為了獲得更全面和深入的生物學見解，通常需要將這些技術與其他測序技術和驗證實驗相結合，以串聯起整個實驗流程。這種多技術聯用的方法能夠提供多層次的數據，從而更好地理解基因調控網絡、表觀遺傳學機制以及細胞功能。
四．常見的組合分析方式
1、ATAC-seq+RNA-seq:
在常規思路中，RNA-seq通常優先于ATAC-seq進行實驗，獲得差異表達基因后，后續可進一步運用ATAC-seq的motif分析，對啟動子區域的染色體開放性染色質開放性發生變化的差異基因進行深入探究，并識別出特定的轉錄因子結合情況，基于這些分析結果，再進行后續的驗證實驗。
另一個思路是，通過ATAC-seq技術檢測染色質開放區域的DNA，初步看一下分布在基因啟動子區域的差異peak，隨后進行RNA-seq實驗，對差異peak注釋基因與RNA差異表達基因的交集進行功能分析，以揭示其潛在的生物學功能，最終，結合實驗進行驗證，以確保研究結果的準確性。
2、ATAC-seq+Chip-seq+RNA-seq:
ATAC-seq之后需要做Chip-seq來做進一步的驗證。比如ATAC-seq得到染色質開放區域的差異peak后，通過motif分析篩到了轉錄因子，隨后利用Chip-seq可以精確地定位這些轉錄因子作用位點。這一步用于揭示哪些轉錄因子通過與開放染色質區域的可及性的變化，進而對下游目標基因產生影響。最后可以通過RNA-seq確認可以驗證這些轉錄因子靶向的基因中哪些基因表達發生了顯著變化，進一步探究這些基因如何通過特定的信號通路影響最終的表型變化。通過“染色質可及性變化－轉錄因子－靶基因－通路－表型”串聯起整個調控網絡。
五．項目文章
下面，小派將為大家分享兩篇關于ATAC-seq和Chip-seq與其他技術聯用分析的項目文章。這些文章展示了如何巧妙地將這兩種強大的技術與其他方法結合，共同攻堅克難，撥開重重迷霧，揭示出隱藏在復雜生物現象背后的真相。
項目文章一
CUT&Tag、ATAC-seq助力揭秘神經肽信號調控T細胞分化
(IF= 50.5)
文章題目：Neuropeptide signaling orchestrates T cell differentiation
文章期刊：Nature
技術手段：CUT&Tag、ATAC-seq、scRNA-seq、RNA-seq
技術路徑：
主要研究結果
CGRP-RAMP3-cAMP 軸激活 STAT1
為了深入理解CGRP如何誘導TH1細胞程序，作者對經CGRP處理的CD4+ T細胞進行了轉錄組和ATAC-seq分析。研究發現，在TH1或TH2細胞分化條件下，CGRP誘導的染色質可及性和表達譜發生了變化（圖5a）。具體來說，對CGRP的反應中TH1細胞早期調節基因如Il12rb2、Il18r1和Stat1的表達上調（圖5b），這些基因位點的染色質可及性也更高（圖5c、d）。這表明CGRP通過改變染色質的可及性，促進了TH1細胞的早期調節基因表達，從而促進TH1細胞的分化。
CGRP增加了與IFNγ信號通路相關的基因的染色質可及性，如Irf4、Irf8、Gbp7、Rap1a和Socs1，在TH1和TH2細胞條件下均是如此（圖5e）。同時，TH2細胞調節因子Gata3和Il13在CGRP處理后失去了染色質可及性（圖5f）。因此，CGRP通過表觀遺傳重構調節TH細胞亞型分化。
在T細胞中，p-CREB和ATF3都被CGRP誘導（圖5g），CREB在Atf3基因啟動子的結合位點通過CUT&TAG和ChIP-qPCR檢測在T細胞中得到確認（圖5i）。CGRP增強的TH1細胞分化和CGRP誘導的Stat1在Atf3缺陷的T細胞中都被取消了（圖5j），這表明CGRP通過ATF3誘導Stat1。作者進行了ChIP-qPCR并發現ATF3結合到Stat1的啟動子區域（圖5k）并誘導Stat1基因表達。最后，CGRP誘導的TH1細胞早期調節因子（Stat4和Il12rb2）在Stat1缺陷細胞中被取消了（圖5l）。總的來說，RAMP3-CREB-ATF3通過誘導關鍵轉錄因子STAT1來調節TH1細胞分化。
圖5：CGRP-RAMP3-cAMP通過表觀基因組重塑和STAT1激活增強TH1細胞分化
項目文章一分析結果詳細結果可見往期軟文：派森諾客戶表觀組學研究成果榮登《Nature》?。?！CUT&Tag、ATAC-seq助力揭秘神經肽信號調控T細胞分化
項目文章二
BRD9介導的染色質重塑通過負反饋機制抑制破骨形成
(IF= 17.7)
文章題目：chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism
文章期刊：Nature Communications
技術手段：Chip-seq、ATAC-seq、RNA-seq
技術路徑：
主要研究成果
BRD9通過干擾素-β 信號傳導抑制破骨細胞生成
在破骨細胞與M-CSF和RANKL (MR+iBRD9) 和對照組 (MR+vector) 分化過程中，對BMDMs進行了mRNA測序。在生物過程中，GO term主要富集在防御反應、對干擾素-β (IFN-β)和外部刺激的反應、免疫系統過程(圖4b)。GSEA揭示了IFN-β 反應、乙酰膽堿受體信號和免疫受體活性在MR+iBRD9組被顯著下調，而核糖體生物發生、突觸傳遞和rRNA加工被上調 (圖4c，d)。RANKL在破骨細胞形成過程中激活IFN-β，STAT1，STAT2，從而促進IFN-β 信號傳導 (圖4e)。而在iBRD9處理后，RANKL誘導的BMDMs中IFN-β 信號活性被下調 (圖4f)。我們認為BMDMs中brd9介導的IFN-β信號通路的可能負反饋調節破骨細胞的形成。
圖4：BRD9介導的干擾素-β信號的轉錄激活負調控破骨細胞的形成
Stat1抑制BRD9介導破骨細胞生成至關重要
為了進一步闡明BRD9如何在RANKL誘導的破骨細胞生成的負反饋過程中參與轉錄調控，進行了ChIP 測序。KEGG富集分析揭示了BRD9的關鍵轉錄調控在信號轉導、信號分子和相互作用以及免疫應答方面的富集 。蛋白質-蛋白質相互作用 (PPI) 分析確定了基因列表中的幾個關鍵樞紐基因可能是BRD9的直接下游靶標。通過一系列分子實驗，結果表明，BRD9通過直接調控Stat1的啟動子和增強子活性來促進Stat1的轉錄 (圖5)。
圖5：在破骨細胞形成過程中，STAT1對于BRD9介導的負反饋調節至關重要
FOXP1與BRD9在Stat1轉錄調控上相互作用
為了研究BRD9的染色質重塑功能以及可能促進BRD9在破骨細胞形成中的負面作用的輔助因子，進行了ATAC-seq和motif分析。結果表明MXI1、SRY、Arid3a、ZNF354C、FOXP1與BRD9有潛在的協同作用。共免疫沉淀 (IP) 證實了BRD9和FOXP1之間的相互作用 (圖6)。利用慢病毒載體進行了ChIP-qPCR和FOXP1敲低實驗，進一步驗證FOXP1對Stat1的結合和轉錄調控功能（圖6k，I）。這些結果清楚地表明，在Stat1轉錄激活期間，FOXP1是BRD9的關鍵輔因子之一，并且在破骨細胞分化期間負反饋調節。
圖6: FOXP1與BRD9相互作用，在破骨細胞形成過程中調節Stat1的轉錄
文章二分析結果詳細結果可見往期軟文：【派森諾多組學項目文章】轉錄組+ChIP-seq+ATAC-seq共同揭示BRD9在破骨細胞形成過程中的負反饋機制
六．表觀遺傳研究高分文章常見實驗技術
（1）ChIP-qPCR （染色質免疫共沉淀定量PCR）：
原理：通過特異性抗體捕獲與DNA結合的蛋白質，然后通過qPCR定量特定區域的富集程度。
應用：驗證ChIP-seq數據中的特定結合位點，或者在沒有進行全基因組測序的情況下，檢測特定區域的蛋白質-DNA相互作用。
（2）Co-IP （共免疫沉淀）：
原理：使用一種特異性抗體捕獲目標蛋白及其相互作用的伴侶蛋白，從而鑒定蛋白質復合物。
應用：研究蛋白質-蛋白質相互作用，特別是在表觀遺傳調控復合物的研究中非常有用。
（3）EMSA （電泳遷移率變動分析）：
原理：通過凝膠電泳檢測蛋白質與DNA片段的結合情況。
應用：驗證轉錄因子或其他蛋白質與特定DNA序列的直接結合。
（4）DNase I 超敏感位點分析 (DNase I hypersensitivity site analysis, DHS)：
原理：利用DNase I酶消化開放染色質區域，然后通過Southern blot或PCR檢測。
應用：識別和定位開放染色質區域，這些區域通常是活性調節元件（如啟動子、增強子）。
（5）Bisulfite PCR：
原理：使用亞硫酸氫鹽處理DNA，將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，然后通過PCR擴增并測序。
應用：檢測特定CpG位點的DNA甲基化狀態。
（6）Western Blot：
原理：通過電泳分離蛋白質，然后用特異性抗體檢測特定蛋白質的存在和表達水平。
應用：驗證組蛋白修飾、轉錄因子或其他相關蛋白質的表達水平。
（7）Reporter Assay （報告基因檢測）：
原理：將感興趣的啟動子或增強子序列克隆到報告基因載體中，然后轉染細胞并檢測報告基因的表達。
應用：評估特定調控序列的功能和活性。
（8）過表達
原理：通過將目標基因的cDNA克隆到表達載體中，然后將該載體轉染到細胞中，使目標基因在細胞中高水平表達?？梢允褂貌煌膯幼觼砜刂票磉_水平，常用的有CMV（巨細胞病毒）啟動子和EF1α（延伸因子1α）啟動子。
應用：功能驗證：研究特定基因或蛋白質的功能，特別是在表觀遺傳調控中的作用。
機制研究：探索特定基因或蛋白質如何影響其他基因的表達、細胞周期、細胞分化等。
信號通路分析：確定特定基因或蛋白質在信號傳導通路中的位置和作用。
常用技術：質粒轉染；病毒載體；CRISPR/Cas9
（9）敲除實驗
原理：通過基因編輯技術（如CRISPR/Cas9）刪除或失活目標基因，使其無法表達。
可以實現完全敲除（KO）或條件性敲除（Conditional KO），后者可以在特定時間和/或特定細胞類型中進行敲除。
應用：功能驗證：研究特定基因或蛋白質在細胞功能和表觀遺傳調控中的必要性。
機制研究：探索特定基因或蛋白質缺失后對細胞行為、信號通路和其他基因表達的影響。
疾病模型：構建基因敲除動物模型，研究特定基因在疾病發生發展中的作用。
常用技術：CRISPR/Cas9；Cre-LoxP系統。
七．聯用示例
ChIP-qPCR + 過表達/敲除實驗：
目的：驗證特定轉錄因子或組蛋白修飾酶在特定基因調控區域的作用。
方法：先進行過表達或敲除實驗，改變目標基因的表達水平。
然后進行ChIP-qPCR，檢測特定調控區域的蛋白質-DNA相互作用是否發生變化。
例如，通過表達某個轉錄因子后，通過ChIP-qPCR檢測其在靶基因啟動子區域的富集程度是否增加。
Co-IP + 過表達/敲除實驗：
目的：驗證特定蛋白質與其他蛋白質的相互作用。
方法：先進行過表達或敲除實驗，改變目標蛋白質的表達水平。然后進行Co-IP實驗，檢測目標蛋白質與其伴侶蛋白質的相互作用是否受到影響。
例如，敲除某個組蛋白修飾酶后，通過Co-IP檢測其與特定轉錄因子的相互作用是否減弱。
通過這些聯用實驗，研究人員可以更全面地理解特定基因或蛋白質在表觀遺傳調控中的作用及其對細胞功能的影響。
八．最后小Tip
不同測序技術和結果整合起來仍然面臨一些挑戰。多組學測序的高成本、結果的統一標準化難題以及不同實驗批次效應的干擾，都影響了數據的結果。
因此，在開展實驗研究之前，若研究者對特定基因或轉錄因子感興趣，建議通過檢索相關數據庫來探索潛在的靶向關系。目前存在專門的轉錄因子研究網站，可輸入相應的motif序列或基因序列，網站會找到相對應的轉錄因子（可能是其他人文章驗證過的或者預測的），常見的數據庫有以下幾個：
（1）AnimalTFDB:
提供了多種搜索瀏覽方式（Famliy、Species或自定義搜索）、2個在線預測工具Predict TF和Predict TFBS。
網址：https://guolab.wchscu.cn/AnimalTFDB4//#/
（2）PlantTFDB:
包含了從165個物種中預測的320370個TFs，并將其分成58個Family。
網址：https://planttfdb.gao-lab.org/index.php
（3）dbCoRC:
dbCoRC是第一個全面的交互式CRC數據庫，也是核心啟動因子數據庫。
網址：http://cistrome.org/db/#
（4） TRRUST:
TRRUST是一個人工注釋的轉錄調控網絡數據庫，不僅包含轉錄因子對應的靶基因，也包含了轉錄因子間的調控關系，并且提供的TF-target互作信息。
網址：https://www.grnpedia.org/trrust/
（5）TransmiR
TransmiR是收集轉錄因子（TF）-microRNA（miRNA）的數據庫，通過它我們可以找到TF和miRNA之間的調控關系。
網址：http://www.cuilab.cn/transmir
項目文章一原文索引：
https://doi.org/10.1038/s41586-024-08049-w
項目文章二原文索引
https://www.nature.com/articles/s41467-023-37116-5
