2017-04-07
派森諾生物對微生物組rRNA可變區(qū)和ITS序列的高通量測序已取得了一系列豐碩的成果，同時，不僅如此，我們在對微生物代謝所涉及的特定功能基因的研究領(lǐng)域也積累了多年的豐富經(jīng)驗，碩果累累。繼2015年與廈門大學(xué)合作，在《FEMS Microbiology Letters》發(fā)表好氧不產(chǎn)氧光合作用細菌的相關(guān)研究成果之后，近期與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)再次合作，在《Biology and Fertility of Soils》（最新影響因子3.069）上發(fā)表論文，揭示了長期施肥耕作對土壤中堿性磷酸酶代謝菌群的影響。
研究背景
磷元素對植物生長和農(nóng)作物收益至關(guān)重要。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，磷元素通常存在于礦物中而難以直接被植物吸收，卻又很容易流失造成水體的富營養(yǎng)化。同時，土壤中30~50%的磷以有機磷的形式存在，只有當其被磷酸酶礦化成無機磷后，才能被植物和土壤微生物吸收和進一步利用。磷酸酶分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶（Alkaline phosphomonoesterase，ALP），主要由土壤微生物分泌，并在土壤磷元素的代謝循環(huán)中起關(guān)鍵作用。在堿性磷酸酶家族中，phoD基因被認為是土壤中最重要的堿性磷酸酶基因。農(nóng)業(yè)上，長期施肥耕作將會影響土壤中編碼phoD基因的磷代謝微生物群落發(fā)生變化，但是其中的影響和互作關(guān)系還尚未被充分研究。
研究目的
長期施肥將會影響土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)及其可用性，為揭示其具體作用方式，本研究探討不同的長期施肥方式對土壤有機磷組分、編碼堿性磷酸酶ALP基因的微生物群落組成以及堿性磷酸酶活性的影響，并比較不同土壤顆粒組分中，編碼phoD基因的微生物群落對不同施肥方式的響應(yīng)。
研究方法
測序技術(shù)：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組phoD基因測序
實驗對象：5種不同處理下的長期施肥（從1981年起）土壤
實驗設(shè)計：不施肥對照組（CK）、全礦物肥組（NPK）、中劑量有機肥和礦物肥混合組（MNPK）、高劑量有機肥和礦物肥組（HMNPK）、全有機肥組（M），每個處理取3個生物學(xué)重復(fù)，共15個樣品，每份樣品取自地下0~20 cm處的土壤，在每個點取10個直徑5cm的樣本并混合均勻。
研究結(jié)果
對15份土壤樣品進行土壤理化性質(zhì)分析、堿性磷酸酶活性檢測、phoD基因的定量PCR檢測、phoD基因高通量測序等實驗，并對高通量測序結(jié)果進行物種組成和豐度差異比較分析。
不同的施肥處理方式顯著影響了土壤的理化性質(zhì)，例如pH值在M組和HMNPK組里有所升高，而在NPK、MNPK及CK組都呈下降趨勢。
ALP酶活檢測顯示M組里ALP酶活最高，CK組次之，而在NPK組最低。
實時熒光定量PCR檢測phoD基因的結(jié)果表明，其變化趨勢與ALP酶的活性類似，M組最高而NPK組最低；在土壤不同組分中，編碼phoD基因的功能菌數(shù)量差異明顯，在泥沙組分里（2~63 mm）豐度最多，在粗砂組分里（200~2000 mm）豐度最少，且不同土壤組分中功能菌的相對豐度與施肥處理方式有關(guān)。
編碼phoD基因的功能菌的Alpha多樣性指數(shù)分析，M組和CK組的多樣性顯著低于其它三組。
RDA冗余分析結(jié)果表明，不同施肥處理組的phoD功能菌（以不同顏色的實心圓圈表示）整體組成差異顯著；紅色箭頭射線代表各類解釋因子和響應(yīng)變量，射線越長，表明該因素對土壤中phoD功能菌的影響越大，如ALP活性、pH值、土壤EC值、磷元素總量（TP）、可利用磷含量（AP）、不穩(wěn)定有機磷含量（LPo）、鈣離子濃度（Ca2+）、土壤有機碳濃度（Corg）、溶解有機碳濃度（DOC）等，都和phoD功能菌組成高度相關(guān)。
系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，土壤中phoD功能菌的在門水平主要由Actinobacteria和Proteobacteria組成，在屬水平主要包括Actinoplanes、Micromonospora、Streptomyces、Bradyrhizobium、Burkholderia和Lysobacter。
通過結(jié)構(gòu)方程模型可知，phoD功能菌的組成和豐度、以及pH值等因素都能顯著影響ALP活性，并能解釋土壤中ALP酶活98%的變化，而土壤細菌總量、溶解有機碳濃度（DOC）等因素則從中介導(dǎo)了上述影響過程。
總結(jié)
本研究打破固有的基于rRNA基因的菌群組成高通量測序思路，通過phoD基因?qū)α状x相關(guān)的功能菌群進行測序分析，更加準確高效地對編碼堿性磷酸酶的微生物組進行研究，并結(jié)合酶活測定、實時熒光定量qPCR等方法，系統(tǒng)揭示了不同施肥處理在長期作用下，對土壤磷代謝微生物群落的影響，從而為農(nóng)業(yè)耕作和土壤管理提供有力的科學(xué)根據(jù)。
本研究的測序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Gongwen Luo, Ning Ling, Paolo Nannipieri, Huan Chen, Waseem Raza, Min Wang, Shiwei Guo, Qirong Shen. (2017). Long-term fertilisation regimes affect the composition of the alkaline phosphomonoesterase encoding microbial community of a vertisol and its derivative soil fractions. Biol Fertil Soils. . doi: 10.1007/s00374-017-1183-3
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