2024-11-18
文章題目：High-throughput profiling of antibiotic resistance gene dynamic in a drinking water river-reservoir system
期刊：Water Research
發(fā)表時(shí)間：2019年2月
●●● 研究背景 ●●●
抗生素耐藥性及其相關(guān)基因（ARGs）的日益增加與傳播，已成為21世紀(jì)全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一大嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。值得注意的是，抗生素耐藥性的存在并非新近現(xiàn)象，而是一個(gè)古老且自然的過程。然而，自1942年青霉素首次應(yīng)用于臨床以來，由于現(xiàn)代抗生素的過度使用和不當(dāng)應(yīng)用，導(dǎo)致ARGs的快速演化與廣泛擴(kuò)散。河流生態(tài)系統(tǒng)尤其容易受到人類活動(dòng)的影響，例如畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)和城市污水排放等，均會(huì)將各類化學(xué)與生物污染物引入河流領(lǐng)域。最新研究表明，我國每年大約有24,748噸抗生素及9.47×10^13個(gè)ARGs單位/人/日被排入河流及其相連的水體之中。相比之下，多數(shù)水庫地處偏遠(yuǎn)且未受嚴(yán)重干擾的自然環(huán)境中，除了接收來自上游河流的來水之外，基本不會(huì)受到其他類型的人為活動(dòng)影響，因而常被視為關(guān)鍵的飲用水源地。因此，在抗生素與ARGs污染程度上，水庫水體通常比河流系統(tǒng)要低得多，顯示出更好的水質(zhì)狀況。
以往的研究主要集中在河流、水庫、河口以及人工水體中抗性基因（ARGs）的出現(xiàn)與分布情況。盡管河流-水庫系統(tǒng)在生態(tài)上的重要性已得到廣泛認(rèn)同，但關(guān)于這一系統(tǒng)中ARGs的具體分布特征，仍缺乏足夠的研究。值得注意的是，現(xiàn)有的文獻(xiàn)雖然總結(jié)了影響不同環(huán)境ARG動(dòng)態(tài)的關(guān)鍵因素，但在某些方面結(jié)論尚存分歧。此外，關(guān)于這些因素如何具體影響ARGs的研究，特別是基于實(shí)地?cái)?shù)據(jù)的研究，依然相當(dāng)稀缺。因此，對(duì)河流-水庫系統(tǒng)內(nèi)ARGs的譜型及其影響因素進(jìn)行全面調(diào)查至關(guān)重要。這不僅有助于深化我們對(duì)自然水體中ARGs行為模式的理解，填補(bǔ)現(xiàn)有的知識(shí)空白，更為應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)峻的抗生素耐藥性挑戰(zhàn)提供了科學(xué)依據(jù)，助力制定有效的管理措施。
●●● 研究思路 ●●●
選址和取樣：亞熱帶河流-水庫系統(tǒng)中進(jìn)行樣本采集，覆蓋流域面積5150 km2。這一水系位于人口密集區(qū)域，由兩條主要支流構(gòu)成，正面臨嚴(yán)重的非點(diǎn)源污染問題，包括但不限于工業(yè)廢水排放、畜牧業(yè)廢水以及農(nóng)業(yè)徑流。這些污染物最終匯入一個(gè)位于較為原始地帶的大型深水庫。總體而言，本研究探討的環(huán)境梯度涵蓋了從河流到水庫水系間水文條件的變化及人類活動(dòng)強(qiáng)度的不同，這一現(xiàn)象在其他流域中也普遍存在。調(diào)查分別在三個(gè)季節(jié)開展，從8個(gè)不同采樣點(diǎn)收集地表水、中層水和底水，制成復(fù)合樣本。所有樣本在分析前即刻送往實(shí)驗(yàn)室，并在4oC的條件下保存。
DNA提取與處理：使用EZNATM Soil and EZNATM Water DNA Kits (OMEGA, USA)試劑盒，然后將合格的DNA調(diào)整至50 ng/μL，保存于- 80oC
QPCR芯片：Wafergen SmartChip Real-time PCR system 用于熒光定量分析。296對(duì)引物使用于本研究中，其中包括285個(gè)抗生素類的ARGs、9個(gè)MGEs（8個(gè)轉(zhuǎn)座酶,1個(gè)通用的I類整合子整合酶基因 cintI-1 ）、1個(gè)臨床I類整合子整合酶基因 intI-1和16S rRNA基因。基因拷貝數(shù)按下式計(jì)算。Gene Copy Number = 10(31?Ct)/(10/3)。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性，所有樣本均進(jìn)行了三次技術(shù)重復(fù)。
同時(shí)，研究細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序。測(cè)定水樣中溶解有機(jī)碳，溶解總氮（DTN）和總磷（DTP）含量。基于對(duì)中國抗生素使用情況的調(diào)研，選取了17種代表性的抗生素作為靶化合物，包括磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺甲氧嘧啶（SMM）和磺胺喹啉（SQX）等。
●●● 數(shù)據(jù)分析 ●●●
Fig 1. (A) 在河流與水庫水系采集的水樣中，檢測(cè)到的ARGs和MGEs（在亞型水平上）的數(shù)量。根據(jù)ARGs產(chǎn)生耐藥性的抗生素進(jìn)行分類：氨基糖苷類、β -內(nèi)酰胺酶、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類-鏈霉素B （MLSB）、多藥磺胺類、四環(huán)素、萬古霉素或其他。(B) 維恩圖展示了河流系統(tǒng)與水庫系統(tǒng)間共有及獨(dú)有ARGs數(shù)量。河水（n = 24）；水庫（n = 15）。
Fig 2. 16S rRNA （A和D）、ARGs （B和E）和MGEs （C和F）不同季節(jié)與環(huán)境梯度下絕對(duì)豐度變化。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)確定對(duì)變異檢驗(yàn)的顯著影響（*:P < 0.05, **:P < 0.05）。
Fig 3. (A) 河流水系和水庫水系的抗生素濃度。(B)河流水系和水庫水系中抗生素濃度與各類ARGs、MGEs和intI-1絕對(duì)豐度之間的Pearson相關(guān)性。右下為相關(guān)系數(shù)的色帶指標(biāo)（*:P < 0.05, **: P < 0.01）。白框表示各參數(shù)間無顯著相關(guān)性（P > 0.05）。∑ARGs：ARGs總和。∑Antibiotics：抗生素總和。
●●● 總結(jié) ●●●
降雨引發(fā)的季節(jié)性徑流可能顯著影響抗性基因（ARGs）和可移動(dòng)遺傳元件（MGEs）的豐度。然而，河流與水庫系統(tǒng)間存在的環(huán)境梯度對(duì)ARGs及MGEs的多樣性、相對(duì)豐度及其分布的影響更為深遠(yuǎn)。這些環(huán)境梯度不僅能夠顯著改變致病菌群落與非致病菌群落的分布格局，還會(huì)影響ARGs亞型之間以及MGEs間的共存模式。結(jié)構(gòu)方程模型分析顯示，在河流-水庫系統(tǒng)中，MGEs對(duì)抗性基因譜型的形成起著最關(guān)鍵的作用。此外，環(huán)境梯度可能通過調(diào)節(jié)MGEs、抗生素濃度、致病菌群落及非致病菌群落等因素，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)該系統(tǒng)內(nèi)抗性基因譜型的變化。
