2024-11-11
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)正在徹底改變我們對發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)和疾病病理學(xué)的理解，它能夠在原生組織環(huán)境中繪制復(fù)雜的基因表達模式。然而，目前該領(lǐng)域的研究主要集中在信使RNA（mRNA）表達的分析上。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組包含各種動態(tài)和多樣的RNA分子，不僅包括編碼蛋白質(zhì)合成的成熟mRNA，還包括RNA可變剪接體、小RNA和其他具有調(diào)控功能的非編碼RNA。因此，對不同種類的RNA分子在其生命周期中的空間分析對于解析復(fù)雜組織中的RNA生物學(xué)全貌至關(guān)重要。
此外，在臨床實踐中，福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-fixed Paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織是病理學(xué)診斷的基石。全世界的臨床病理科積累了大量FFPE組織塊，這些材料與詳細(xì)的臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，構(gòu)成了尚未充分利用的人體生物學(xué)和轉(zhuǎn)化研究的寶貴資源。然而，F(xiàn)FPE樣本也帶來了特定挑戰(zhàn)。在石蠟包埋過程中，樣本中的RNA高度片段化，并且在室溫儲存條件下進一步降解。因此，對臨床級FFPE樣本中的RNA分子進行空間分析極為困難。
2024年9月30日，來自耶魯大學(xué)樊榮團隊的研究人員在Cell發(fā)表了題為“Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues”的研究論文。該平臺巧妙地利用FFPE樣本中自然發(fā)生的RNA片段化，向廣泛多樣的RNA分子原位添加poly(A)尾，結(jié)合微流控條形碼標(biāo)記和算法創(chuàng)新，成功實現(xiàn)了對臨床存檔FFPE組織的全覆蓋、逐堿基的空間全轉(zhuǎn)錄組測序。Patho-DBiT通過對完整mRNA、缺失poly(A)尾的片段化mRNA、各類大/小非編碼RNA、剪接異構(gòu)體以及攜帶單核苷酸變異（SNV）的前體RNA進行空間條形碼標(biāo)記，精確解碼了FFPE復(fù)雜組織中豐富的RNA生物學(xué)信息，包括單細(xì)胞級mRNA圖譜、非編碼RNA表達、可變剪接、遺傳變異、microRNA調(diào)控及RNA動態(tài)變化等。
技術(shù)原理
Patho-DBIT技術(shù)利用FFPE樣本中自然發(fā)生的RNA片段化過程。在組織切片制備過程中，樣本中的RNA經(jīng)歷不同程度的片段化。通過向這些片段化的RNA分子原位添加poly(A)尾，增強了這些RNA分子的標(biāo)記和穩(wěn)定性，使其能夠在后續(xù)步驟中進行有效的測序。通過微流控技術(shù)，Patho-DBIT能夠在組織樣本中以極高的分辨率（可達100×100的網(wǎng)格）進行條形碼標(biāo)記。每個標(biāo)記的RNA分子都被賦予一個獨特的條形碼，用于后續(xù)的空間定位和數(shù)據(jù)分析（圖1）。結(jié)合創(chuàng)新的算法，Patho-DBIT能夠精確解碼FFPE組織樣本中豐富的RNA生物學(xué)信息，包括完整的mRNA、片段化mRNA、非編碼RNA、剪接異構(gòu)體以及攜帶單核苷酸變異（SNV）的前體RNA，從而精準(zhǔn)解碼FFPE復(fù)雜組織中的豐富RNA生物學(xué)信息，包括單細(xì)胞級mRNA表達譜、非編碼RNA表達、可變剪接、遺傳變異、microRNA調(diào)控以及RNA動態(tài)變化等。
圖1 Patho-DBiT技術(shù)流程及全場景空間分析能力
研究內(nèi)容
1、小鼠胚胎Patho-DBiT設(shè)計及空間全轉(zhuǎn)錄組定位
研究中使用50 mm像素大小的裝置將Patho-DBiT應(yīng)用于E13小鼠胚胎FFPE切片。無監(jiān)督聚類顯示了20個轉(zhuǎn)錄組簇，空間UMAP與H&E染色的相鄰切片的組織學(xué)緊密一致。Patho-DBiT平均每像素檢測到5,480個基因和15,381個獨特的分子標(biāo)識符（UMIs），全基因組泛mRNA和UMI圖譜顯示出與組織形態(tài)和密度的強烈一致性。在相鄰切片上進行的重復(fù)重復(fù)性非常高。
圖2 Patho-DBiT在E13小鼠胚胎切片上的表現(xiàn)
2、小鼠大腦中區(qū)域特異性替代剪接和A-to-I RNA編輯的空間共譜分析
研究團隊在不同組織類型和空間分辨率下對Patho-DBiT進行了充分驗證。在小鼠腦冠狀切片的分析中，Patho-DBiT在50 μm的空間像素中平均檢測到6786個基因和31063個獨特分子標(biāo)記（UMI）。聚類分析精確重構(gòu)了大腦組織的解剖結(jié)構(gòu)，其空間排列與Allen小鼠大腦圖譜上相似切片的區(qū)域注釋高度一致。此外，Patho-DBiT捕獲了調(diào)控大腦重要功能的基因及其區(qū)域性剪接異構(gòu)體的表達，以至少需要2個剪接連接跨越讀數(shù)（splice-junction-spanning read counts）為標(biāo)準(zhǔn)，研究人員在2,368個基因中共檢測到3,879個不同的可變剪接事件，包括外顯子跳躍（SE）、內(nèi)含子保留（RI）、3'選擇性剪接位點（A3SS）、5'選擇性剪接位點（A5SS）和外顯子互斥（MXE）等，其空間分布與一套獨立的、通過長讀長納米孔測序獲得的新鮮冷凍腦樣本數(shù)據(jù)相吻合。
圖3 小鼠腦基因表達和RNA加工的空間共定位
3、Patho-DBiT概述了臨床檔案AITL樣本的淋巴瘤發(fā)生生物學(xué)
接下來，作者將空間分析擴展到臨床存檔的FFPE 組織。無監(jiān)督聚類揭示了10個空間組織簇與組織學(xué)結(jié)構(gòu)對齊，UMAP平均包含5364個基因，每像素11989個UMAP，描述了標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記定義的不同細(xì)胞類型。為了評估這種長期儲存的FFPE切片的捕獲準(zhǔn)確性，研究團隊使用索引共檢測（CODEX）法對相鄰組織切片進行了高復(fù)雜性空間細(xì)胞分型。
接下來，作者將空間分析擴展到臨床存檔的FFPE組織。使用Patho-DBiT對一名診斷為血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤（AITL）的患者皮下結(jié)節(jié)獲得的組織切片進行條形碼（圖4）。這個嵌塊在進行實驗之前，已經(jīng)在室溫下保存了5年多。無監(jiān)督聚類顯示了10個空間組織的聚類與組織學(xué)結(jié)構(gòu)對齊。UMAP平均每像素有5364個基因和11989個UMIs，描述了由典型標(biāo)記定義的不同細(xì)胞類型。為了評估這個長期存儲的FFPE切片的捕獲準(zhǔn)確性，我們使用索引（CODEX）共檢測對相鄰組織切片進行了高倍空間細(xì)胞分型。增殖標(biāo)志物MKI67和PDCD1經(jīng)常在惡性AITL細(xì)胞上表達，在本切片中呈致密的結(jié)節(jié)狀分布，與CODEX鑒定一致。
圖4 儲存5年的AITL樣本的高靈敏度空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)
4、通過整合擴展Patho-DBiT與高分辨率組織學(xué)的超分辨率組織結(jié)構(gòu)
研究團隊使用了100×100微流控設(shè)備，以20 μm的像素分辨率對10,000個點進行條形碼標(biāo)記，成功對一例診斷為黏膜相關(guān)淋巴組織邊緣區(qū)淋巴瘤（MALT）的臨床腫瘤活檢樣本進行了空間解析。該樣本已在室溫下存放超過三年。通過Patho-DBiT平臺，團隊在一次實驗中獲得了該樣本的多重信息。對基因表達矩陣進行無監(jiān)督聚類分析后，識別出了20個亞群，這些亞群的空間分布與組織學(xué)結(jié)構(gòu)高度一致。即使是數(shù)量較少的特定細(xì)胞類型，Patho-DBiT也能夠精確檢測，并通過免疫熒光染色進一步驗證了結(jié)果的可靠性。
圖5 通過將病理DBiT與組織學(xué)相結(jié)合，解決了高分辨率的組織結(jié)構(gòu)問題
5、用于腫瘤鑒別的基因組尺度空間序列變異分析
序列變異在RNA轉(zhuǎn)錄本中很常見，在很大程度上反映了潛在的基因突變或RNA編輯。研究團隊進一步使用最新開發(fā)的計算平臺iStar，將分層組織學(xué)圖像特征提取與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)相融合，成功實現(xiàn)了單細(xì)胞水平的空間基因表達映射，大幅提升了空間細(xì)胞異質(zhì)性的解析能力（圖6）。其次，Patho-DBiT能夠捕獲全基因組范圍內(nèi)的序列變異，并生成空間SNV表達矩陣。它無需依賴已知標(biāo)記物，通過無監(jiān)督聚類即可區(qū)分腫瘤亞克隆與非惡性細(xì)胞，并預(yù)測克隆進化關(guān)系。此外，該MALT組織的測序數(shù)據(jù)中有35%的序列映射到了非編碼RNA，Patho-DBiT捕捉到了從數(shù)十到數(shù)千種不同非編碼RNA分子的空間分布及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。
圖6 用于區(qū)分惡性亞克隆的全基因組空間變異分析
總 結(jié)
Patho-DBiT技術(shù)具有廣泛應(yīng)用性，不僅可用于小RNA和miRNA的空間表達譜，還可用于探索RNA后轉(zhuǎn)錄修飾與空間基因表達模式。它展現(xiàn)了從冷凍組織到陳舊FFPE樣本的兼容性。此外，在FFPE樣本上具有巨大潛力，該技術(shù)在FFPE樣本上展示了極高的空間分辨率，為過去的病理樣本提供了重要的分析機會。例如，在分析5年儲存的AITL樣本和3年儲存的MALT組織時，該技術(shù)展示了對基因表達、基因組突變、小RNA網(wǎng)絡(luò)和剪接動態(tài)的多層次分析。未來在臨床的應(yīng)用中，Patho-DBiT可深入了解不同腫瘤細(xì)胞在不同微環(huán)境中的存活機制，幫助識別病變進展和耐藥性的特定癌細(xì)胞基因型或克隆型。這可能幫助個體化治療方案的制定，如探索特定藥物（如ROCK1抑制劑）對特定患者的潛在療效。
