2024-11-03
文章題目：National-scale antimicrobial resistance surveillance in wastewater: A comparative analysis of HT qPCR and metagenomic approaches 期刊：Water Research 影響因子：13.4 發表時間：2024年9月15日
研究背景
抗生素耐藥性（AMR）是一個復雜的問題，其影響遍及人類、動物和環境等各個方面。考慮到其多因素的性質，人們更加強調在“一個健康”的視角下解決問題，從而認識到這些不同方面從根本上是相互關聯的。廢水是抗生素耐藥性（AMR）的重要儲存庫，對其進行監測可以深入了解人群層面的AMR趨勢，為公共衛生政策提供信息依據。 雖然國家廢水監測可以進一步加深我們對廢水中抗生素耐藥性的理解，但監測數據的價值取決于將監測計劃的目標與最合適的方法相結合。目前對于環境中抗生素抗性基因的研究，主要有宏基因組和高通量qPCR兩種方法，之前的研究表明，宏基因組學的非靶向性提供了更廣泛覆蓋ARG譜的明顯優勢，但會降低方法的靈敏度，而qPCR通常對低豐度基因更敏感。總的來說，對這兩種方法的優缺點和一致性進行全面比較的研究仍然有限，尤其是在廢水監測方向。 本研究旨在區分威爾士全國廢水的空間和時間AMR分布的變化，并進一步評估高通量qPCR芯片和宏基因組學對不同監測目標的適用性。為此，每周從47個威爾士污水處理廠收集綜合進水樣本，并從一家大型市政醫院收集進一步的出水樣本（圖1）。比較了這兩種方法的基因覆蓋率、監測高風險ARGs（定義為移動遺傳元件（MGEs）、致病宿主和人為相關的ARGs）的能力，以及它們捕捉與環境變量和微生物群落有關的抗生素抗性基因組成變化的能力。 圖1 地圖顯示用于樣本收集的47個城市污水處理廠和醫院
研究方法
1、廢水樣品采集和處理 2、廢水DNA提取 3、高通量qPCR（共使用96組引物進行高通量qPCR實驗，其中ARGs（73個基因）、MGEs（10個基因）、病原菌（5個基因）以及金屬和殺菌劑抗性基因等8個其他基因） 4、宏基因組文庫的構建和測序 5、序列數據的生物信息學分析 6、統計分析
研究結果
兩種方法對廢水中ARGs數量和豐度量化的影響 在污水處理廠污水和醫院污水中平均分別觀察到181和227個個體arg（圖2.A）。在所有樣本中總共檢測到491個獨特的ARGs，其中61個也通過qPCR芯片檢測到（圖2.C）。雖然 qPCR芯片僅限于73種目標ARGs，但兩種方法都能在醫院廢水樣本中檢測到顯著性更高的豐富度。盡管如此，宏基因組分析在污水處理廠污水中檢測到的獨特ARGs數量高于醫院污水（圖2.B），這可能是由于污水處理廠的采樣點數量更多。 圖2（A）所有醫院和污水處理廠樣本中通過qPCR芯片和宏基因組（注意y軸尺度的不同）確定的ARG豐富度分布的箱形圖。(B)韋恩圖顯示了通過qPCR芯片和宏基因組確定的醫院和污水處理廠中檢測到的獨特arg的數量。(C)維恩圖顯示了通過qPCR芯片和宏基因組在所有廢水樣本中檢測到的唯一ARGs的總數。注意，只有73個ARGs引物在 qPCR芯片上使用 無論是qPCR芯片還是宏基因座數據，污水處理廠樣本中ARGs的總相對豐度都明顯低于醫院廢水。大環內酯類酰胺鏈霉素（MLS）、四環素、β-內酰胺和氨基糖苷類抗菌藥物的ARGs在兩組數據中都占主導地位（圖3A和B)。兩組數據中醫院廢水中糖肽抗性基因的相對豐度顯著增加。然而，宏基因組數據中進一步揭示了利福平和阿爾法霉素的ARGs的高豐度，而qPCR芯片由于沒有使用對應引物，所以沒有對應的檢測數據。 圖3 標準化的相對豐度 (A)由qPCR芯片和宏基因組確定的目標ARG組，以及(B)完整宏基因組數據中的ARG類別，取所有污水處理廠和兩個廢水來源的所有時間點的平均值 在73個qPCR芯片檢測的ARGs范圍內，廢水樣品中只有mecA未被檢測到（圖2.B）。相比之下，宏基因組分別在污水處理廠廢水和醫院廢水中檢測到54和58個qPCR芯片目標ARGs。其中未被檢測出的包括部分高風險的arg，如mdtL、blaNDM和blaVIM。宏基因組數據的檢測頻率一直很低，在至少20%的廢水樣本中，qPCR芯片的73個目標arg中只有35個被檢測到。通過qPCR芯片分析發現，aadA7、qepA和vanA等ARGs的相對豐度較高，而通過宏基因組分析發現，tetW、blaCTX和vanRA的相對豐度較高。 不同樣本類型之間比較發現，qPCR芯片和宏基因組在污水處理廠廢水中msrE和tet39的相對豐度與醫院污水相比，顯著增加方面是一致的，而ermB則相反。宏基因組數據進一步發現，污水處理廠樣本中ctx的相對豐度顯著更高，而醫院樣本中vanRA的相對豐度顯著更高。相比之下，qPCR芯片在醫院樣本中檢測到的aadA7相對豐度要高得多，在污水處理廠樣本中檢測到的vanA相對豐度要高得多。 兩種方法對分析廢水中ARG成分變化的影響 NMDS用于比較醫院和污水處理廠廢水樣本中的ARG組成隨時間的變化。不論是qPCR芯片還是宏基因組，都顯示ARG在不同地點明顯聚集（圖4）。在評估時間變化對ARGs的影響時，采樣時間對污水處理廠樣品的ARG組成沒有明顯的影響。相比之下，醫院樣品的組成在當月發生了明顯的變化。 圖4 基于Hellinger轉換的ARG相對豐度的Bray-Curti矩陣的NMDS排序圖顯示，ARG組成隨時間的變化以及采樣醫院和污水處理廠采樣點之間的差異。通過(A) qPCR芯片和基于(B) qPCR靶向ARGs和(C)完整的宏基因組數據 兩種方法對確定環境和人為因素對廢水ARGs的影響的影響 在評估采樣地點對污水處理廠ARGs組成分布的影響時，NMDS分析發現，ARGs的組成按地理區域聚類，如圖1所示。這種效應在一定程度上可以用離散度來解釋。在這三個地區中，來自北威爾士和南威爾士的ARGs差異最大。相對于16S rRNA基因拷貝數的ARG總豐度也因采樣位點的不同而不同，因此，使用qPCR芯片數據確定的ARG的平均總相對豐度在南威爾士顯著低于北威爾士。 基于距離的冗余分析（dbRDA）顯示，人為變量和環境變量對污水ARGs產生了顯著的影響，qPCR芯片和宏基因組調整后R2分別為0.285 （p < 0.01）和0.207 (p < 0.01)（圖5）。這兩種方法一致發現環境變量導致了ARG譜中更大比例的差異。其中銨的影響最大（R2 = 0）。但是，兩種方法對于某些變量的影響，結果之間存在一些微小的差異。例如，通過對完整數據的宏基因組分析，發現電導率導致的百分比是顯著的，然而在qPCR芯片中并沒有發現這種顯著性(p = 0）。對于人為變量，雖然它們的個體影響在三個數據中均顯著，但每個變量導致的差異百分比較低。 圖5 基于距離的冗余分析（dbRDA）顯示了環境和人為變量對污水處理廠樣品ARG分布的影響。通過(A) qPCR芯片和基于(B) qPCR靶向ARGs和(C)完整數據集的宏基因組測定 兩種方法對ARGs與細菌屬關系的影響 不同樣本微生物群落的組成在污水處理廠和醫院廢水之間存在差異，它們與ARGs的組成相關（PERMANOVA p < 0.01, PERMDISP p > 0.05），并且在醫院廢水樣本中隨著時間的推移發生變化。酸多菌屬（Acidovorax）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）是三個最豐富的屬，其中假單胞菌屬（Pseudomonadota）是所有樣本的優勢屬。 作為潛在宿主細菌的標志，通過網絡分析探索了細菌屬和ARG之間的關聯模式，基于強（ρ > 0.7）和顯著（p < 0.01）的相關性（圖6）。結果表明對四環素類耐藥的ARG與不同屬的相關性最高。例如，qPCR芯片和宏基因組都發現tetO和tetW與兩個高度豐富的桿菌屬Blautia和Faecalibacterium表現出特別強的相關性（ρ > 0.9）。宏基因組發現了qPCR芯片未發現的進一步相關性，包括假單胞菌與MLS ARGs mefA和msrD之間的關系（圖5.B）。然而值得注意的是，無論從哪種方法分析數據，大多數豐富的arg都沒有顯示出與任何細菌屬的任何顯著相關性。 圖6 網絡分析顯示前40個最豐富的ARGs與前20個最豐富的細菌屬之間的關系，由(A) qPCR芯片和(B)宏基因組確定。連接表示強的、顯著的相關性（Spearman相關系數ρ > 0.7, p < 0.01）
結 論
抗生素抗性基因檢測在監測新出現的健康威脅、為公共衛生政策的制定提供信息方面具有巨大潛力，并對未來研究提供巨大價值。本研究全面比較了高通量qPCR芯片技術與宏基因組技術，如表1所示。 表1 高通量qPCR芯片和宏基因組用于監測廢水中AMR的優勢（Green / +）、劣勢（Red / -）和細微差異（琥珀色） 高通量qPCR芯片技術具有更高的靈敏度，可以檢測所有的目標arg，包括低表達的arg豐度。其中包括可移動的金屬-β-內酰胺酶基因blaNDM以及多藥耐藥基因mdtL，這兩種基因都被認為對人類健康構成高風險。qPCR芯片監測低豐度基因的能力將有助于早期發現涉及已確定的高風險ARGs的暴發，并確保常規監測數據的連續性。先前對廢水和糞便的研究也發現，qPCR技術能更好地區分ARG相對豐度的較小偏差。 另一方面，由于高通量 qPCR芯片僅限于檢測預先確定的基因，而宏基因組學可以更好地捕捉抗性基因的多樣性。宏基因組不受特定引物的限制，更適合評估總體ARG水平。宏基因組數據的組裝可以用于將arg與宿主細菌，MGEs和共定位的耐藥基因聯系起來。因此，宏基因組數據有利于實現人類健康風險評估和進化分析等目標。 本研究首次比較了高通量qPCR芯片和宏基因組在廢水中抗生素抗性監測中的應用。它為尋求設計有效的抗微生物藥物及廢水監測策略提供了有價值的指導。宏基因組學可以對ARGs進行全面的概述，并有可能為ARG風險評估提供關鍵的背景信息。高通量qPCR芯片具有更高的靈敏度，能夠反映全ARG分布的組成時空動態。盡管如此，不同方法之間靈敏度和覆蓋率的差異確實影響了檢測到的ARGs及其豐度，影響關于影響因素的數據解讀方式。對每種技術的能力和資源需求的深入了解將有助于使監測工作朝著具體目標發展，加強未來對抗生素抗性基因的監測。 總體而言，宏基因組提供了更全面的抗生素抗性基因譜，而高通量qPCR芯片可以對臨床耐藥重要基因進行敏感定量。我們強調選擇與監測目標一致的適當方法的重要性，從而制定有效的基于環境抗生素抗性傳播的監測計劃。
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