2017-04-12
SMRT（Single Molecule, Real-Time）測序，即單分子實(shí)時(shí)測序，該方法基于納米小孔的單分子讀取技術(shù)，無需擴(kuò)增即可快速完成序列讀取。Pacific Biosciences自2013年成功推出商業(yè)化的三代測序儀PacBio RSII后，三代測序開始被廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中。三代測序技術(shù)通過其獨(dú)有的環(huán)形一致性測序模式（Circular-consensus sequence，CCS），極大提高單堿基測序的準(zhǔn)確率，遠(yuǎn)超Illumina等二代測序技術(shù)。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序項(xiàng)目相比，利用PacBio平臺(tái)的全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以直接獲得mRNA的全長，保證了mRNA序列的精確性。
2017年2月，美國弗吉尼亞理工大學(xué)發(fā)表題為Single molecule RNA sequencing uncovers trans-splicing and improves annotations in Anopheles stephensi的文章，以斑須按蚊為材料，通過全長轉(zhuǎn)錄組測序，揭示基因的反式剪接事件，并優(yōu)化和提升了基因組的注釋。
1. 研究目的
第三代測序技術(shù)與二代測序技術(shù)在讀長上有明顯優(yōu)勢。期望利用三代測序技術(shù)的優(yōu)勢提升斑須按蚊的基因組注釋信息并獲取cDNA的全長；另一方面，反式剪接為物種進(jìn)化過程中發(fā)生的現(xiàn)象，與常規(guī)的剪接方式不同，反式剪接可由來自于不同mRNA前體的外顯子區(qū)域生成，本研究擬通過全長轉(zhuǎn)錄組測序，揭示反式剪接現(xiàn)象。
2. 研究方法
取15頭1-3日齡雄成蟲進(jìn)行混樣，提取總RNA后，利用SMRTer PCR cDNA synthesis試劑盒將mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將構(gòu)建好的文庫用PacBio平臺(tái)進(jìn)行測序。
3. 分析結(jié)果
通過全長轉(zhuǎn)錄組測序，共得到超過60萬條全長cDNA；通過全長轉(zhuǎn)錄組測序，4867個(gè)基因模型升級。全長轉(zhuǎn)錄組新增了3323個(gè)基因mRNA的UTRs信息；新發(fā)現(xiàn)了1785個(gè)可變剪接并界定了外顯子的邊界；1923個(gè)基因重新對外顯子進(jìn)行了調(diào)整或明確發(fā)生基因融合；鑒定出6個(gè)反式剪接事件。
作者以doublesex基因?yàn)槔f明對基因組注釋的改善。在原有的基因注釋信息中，doublesex基因分為兩部分，命名為ASTEI07080和ASTEI07082，通過全長轉(zhuǎn)錄組測序，將這兩部分基因合并為一個(gè)基因模型。
4. 參考文獻(xiàn)
Jiang X et al., Single molecule RNA sequencing uncovers trans-splicing and improves annotations in Anopheles stephensi. Insect Molecular Biology (2017).
