2024-09-20
您是否在夜深人靜的夜里疑惑過，我到底需不需要做單細胞？
您是否在漫長的晚上困擾過，我的樣品類型能不能做單細胞？
您是否在無人的深夜懷疑過，我應(yīng)該選擇誰家來做單細胞？
世界上沒有兩片相同的樹葉，對于細胞來說也是一樣。細胞與細胞之間也存在著異質(zhì)性。這種異質(zhì)性不僅體現(xiàn)在宏觀形態(tài)上，比如相同組織中細胞的類型，狀態(tài)和相互作用差異；也體現(xiàn)在遺傳信息上，比如基因組信息及基因表達水平等差異。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析是使用批量RNA測序（bulk RNA-seq）進行的，測量的是細胞基因表達水平的平均值，非常容易丟失細胞異質(zhì)性的信息，而單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA seq）可以捕獲單個細胞內(nèi)的mRNA，就可以發(fā)現(xiàn)不同細胞之間的異質(zhì)性與小群體細胞的重要功能，彌補了bulk RNA-seq的局限性。 單細胞與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Ρ?/span>
近年來，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域最火的測序技術(shù)，越來越受到科研工作者們的青睞。與此同時，單細胞產(chǎn)品的種類也越來越多，為廣大科研工作者們的學(xué)術(shù)研究帶來了更多的便利與可能性，但琳瑯滿目的產(chǎn)品也讓科研工作者們不知該如何選擇。 基于此，派森諾提供4種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和4種空間轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)品供大家選擇，涵蓋了各種主流單細胞測序，滿足了不同客戶的不同測序需求。 派森諾單細胞空轉(zhuǎn)技術(shù)平臺
那我們應(yīng)該如何根據(jù)自己的需求在這些單細胞、空轉(zhuǎn)產(chǎn)品中選擇適合自己的一款呢？下面小編的分享希望給大家?guī)硪恍┧悸贰?/span> 單細胞轉(zhuǎn)錄組： 派森諾單細胞轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)品
1、3’端單細胞轉(zhuǎn)錄組-最經(jīng)典的單細胞轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品 3’端單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是目前使用最廣泛的單細胞測序產(chǎn)品，基于10x Genomics Chromium平臺的微流控體系，核心原理是通過Ploy T捕獲含Ploy A尾的轉(zhuǎn)錄本，所以適用于所有含Ploy A尾的真核生物。 做3’端單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，有兩個關(guān)鍵點至關(guān)重要。第一，獲得質(zhì)量良好的單細胞懸液，這是提高測序質(zhì)量的必要條件。但不同物種、不同樣本類型的解離成功率相差巨大。經(jīng)過多年的沉淀，派森諾對于樣本解離已有豐富的項目經(jīng)驗。截至2024年派森諾單細胞平臺已成功完成千例單細胞樣本測序，不管是動物樣本如血液、腦組織、脊髓、胰腺、肝臟、腎臟、腸、肺、視網(wǎng)膜等，還是植物樣本如禾本科、十字花科、葫蘆科等都不在話下。特別在如骨組織、胰腺、眼球、皮膚和植物原生質(zhì)體等疑難樣本方面，派森諾都有著豐富的成功解離經(jīng)驗。詳情請看：（擔(dān)心疑難樣本做不了單細胞？先來問問派森諾） 目前派森諾正在舉行疑難樣品免費解離的活動，如果對樣品是否能做單細胞測序有疑問，歡迎聯(lián)系派森諾銷售人員。 第二，細胞注釋準確度。細胞注釋結(jié)果決定了后續(xù)數(shù)據(jù)分析走向，所以注釋結(jié)果對后續(xù)分析影響很大。目前，軟件自動化細胞注釋方法方便且系統(tǒng)化，但完全依賴于參考數(shù)據(jù)集，注釋的結(jié)果并不是高置信度注釋。為了提高細胞注釋的高置信度，防止細胞類型的缺失或者比例異常，需要專業(yè)的人工注釋。在人工注釋中，不僅要對單個細胞的基因表達進行分析，還要對其細胞簇功能富集分析，一方面借助數(shù)據(jù)庫已知的細胞類型marker基因列表，另一方面要查閱大量相關(guān)文獻資料精準鑒定細胞類型，此過程需要專業(yè)的經(jīng)驗且花費大量的時間精力。所以，專業(yè)的人工注釋目前是大家認可的細胞注釋的金標準。派森諾擁有自己的人工注釋團隊，為您的注釋結(jié)果保駕護航。 3’端轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炘?/span>
2、5’端免疫組庫-為T細胞與B細胞而生 5’端免疫組庫目前適用于人和小鼠。免疫細胞針對紛繁復(fù)雜的入侵病原體的免疫反應(yīng)，依賴于其高度多樣性的抗原識別受體B細胞表面受體（BCR）和T細胞表面受體（TCR）。而V（D）J基因是編碼BCR/TCR可變區(qū)的基因，可以通過基因重排產(chǎn)生多種BCR/TCR，使其可以適應(yīng)多種抗原，滿足機體特異性免疫的需求。 基于10×Genomics的單細胞測序系統(tǒng)，可以實現(xiàn)高通量的5’端單細胞轉(zhuǎn)錄組和V（D）J測序，通過微流控系統(tǒng)將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細胞包裹在油滴中；接下來在每個油滴中，凝膠珠溶解，細胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有barcode和UMI 信息的cDNA。破油之后，cDNA一分為二，后續(xù)同時進行基因表達和免疫組庫的文庫構(gòu)建。其中TCR/BCR的V（D）J序列通過設(shè)計在C區(qū)的巢式引物進行PCR富集；而mRNA保留的是5’端的信息，測序后即可獲得大量單細胞的基因表達和免疫組庫數(shù)據(jù)。 5’端免疫組庫實驗原理
3、單細胞ATAC-單細胞染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性分析 染色質(zhì)將大量的DNA壓縮成細胞核，使只有一小部分的DNA可以在每個細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄。10x Genomics可以在單細胞表觀基因組學(xué)水平上揭示染色質(zhì)可接近性。該方案通過快速高效的單細胞標記、測序和分析，可一次性獲得成千上萬個單細胞染色質(zhì)譜，獲得單細胞水平的染色質(zhì)開放區(qū)域信息。 10x ATAC技術(shù)核心是油滴包裹的凝膠珠（GEM），每個凝膠珠都帶有獨特的寡核苷酸條形碼序列，包含P5測序接頭、10xBarcode序列、Read1N序列。Tn5酶孵育單細胞核懸液，Tn5轉(zhuǎn)座酶可以滲透進入細胞核膜，在細胞核內(nèi)完成基因組DNA開放區(qū)的切割。發(fā)生轉(zhuǎn)座反應(yīng)的DNA，包含不同大小的片段，在被轉(zhuǎn)座酶處理后，細胞核中的基因組開放區(qū)已經(jīng)被切碎，且被接上了特定的接頭，以便和凝膠珠結(jié)合。在微流控芯片上將孵育好的單細胞核懸液與預(yù)混液、帶有barcode的凝膠珠和分液油進行混合，將成千上萬個細胞核分配到納升級的GEM（Gel Beads-in-emulsion）中， 收集GEMs后，進行線性擴增，來自同一個細胞的DNA片段被標記上同一個barcode，隨后破油純化產(chǎn)物，構(gòu)建可用于測序的NGS文庫。 實驗原理
4、微生物單細胞轉(zhuǎn)錄組測序-微生物也能做單細胞 與細胞一樣，即使是同一個遺傳背景下的微生物也存在異質(zhì)性。在過去，微生物由于其轉(zhuǎn)錄本含量低、半衰期短、拷貝數(shù)低、原核生物無Ploy A尾、細胞膜和細胞壁厚且復(fù)雜等原因無法在高通量單細胞層面研究微生物的異質(zhì)性。經(jīng)過深入的探索與創(chuàng)新，派森諾在使用Tween 20透化細胞膜，溶菌酶溶解細胞壁，胞內(nèi)rRNA去除試劑去除rRNA方面實現(xiàn)重大突破，再通過10x單細胞平臺的微流控體系，使帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細胞包裹在油滴中， 用隨機引物進行mRNA捕獲，實現(xiàn)無polyA尾的mRNA模板轉(zhuǎn)換，并以mRNA為模板反轉(zhuǎn)成cDNA，進行建庫測序。目前，派森諾也是唯一使用10x平臺來做微生物單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的公司，并成功將rRNA占比控制在7%以下。
微生物單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果-數(shù)據(jù)質(zhì)控
微生物單細胞轉(zhuǎn)錄組測序原理 部分結(jié)果展示（大腸桿菌）
空間轉(zhuǎn)錄組： 派森諾空間轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)品 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序雖然能夠積累大量關(guān)于細胞類型特異性基因調(diào)控的信息，但它們在處理過程中破壞了原始組織結(jié)構(gòu)，丟失了空間位置信息。而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠在保留樣本空間位置信息的同時，采用測序技術(shù)獲得基因表達數(shù)據(jù)，從而更全面、直觀地分析組織結(jié)構(gòu)。 單細胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組對比
目前，派森諾共有4種單細胞轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品供大家選擇： (1) 10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組測序-適用于OCT包埋的新鮮冷凍組織 10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組是將組織樣本透化后，mRNA從組織滲透到空間基因表達玻片，再基于Ploy T 捕獲mRNA的Ploy（A）尾，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行建庫測序，其主要在含有空間barcode的玻片上完成。 10x Visium空間基因表達玻片每個捕獲區(qū)域內(nèi)包含約5000個55 μm直徑的帶有空間位置標簽的圓形spot點，spot點之間間隔45 μm，所以其分辨率還未達到單細胞水平。 實驗原理與實驗流程
(2) 10x Visium Cytassist空間轉(zhuǎn)錄組測序-FFPE也能做空間轉(zhuǎn)錄組 2022年底10x Genomics推出了針對人和小鼠的空間轉(zhuǎn)錄組測序方案-Visium CytAssist，打破了石蠟包埋（FFPE）樣本不適合做高通量測序的刻板印象。 與10x Visium相同的是，CytAssist空間基因表達玻片每個捕獲區(qū)域內(nèi)同樣包含5000個55μm直徑的帶有空間位置標簽的圓形spot點，所以分辨率與 Visium相同。 基因表達玻片構(gòu)造 與Visium不同的是， CytAssist是基于探針捕獲的原理來進行mRNA捕獲，基因檢出率更加優(yōu)秀。針對小鼠（2萬個基因）和人（1.8萬個基因）的基因數(shù)據(jù)庫設(shè)計了探針，每一個基因（人和小鼠），都預(yù)先設(shè)計了一對probe（人基因3對，小鼠基因1對）以靶定RNA的特定序列。左端探針包含有read 2結(jié)構(gòu)， 用以后續(xù)PCR擴增，右端探針包含有 poly（A）結(jié)構(gòu)，用以后續(xù)被玻片上的序列結(jié)合。只有兩段探針同時被雜交，探針才會進行連接，若只有一段被捕獲，后續(xù)將無法完成建庫，因此可以有效降低假陽性。之后mRNA模板降解，組織透化后，探針序列從組織原位中滲透出來，與玻片上的寡核苷酸序列發(fā)生互補雜交。最后攜帶空間 barcode的探針序列用于進行測序文庫構(gòu)建和測序。 實驗原理 (3) 10x Visium Cytassist（HD）-更高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組測序 2024年年初，10x Genomics正式推出Visium HD技術(shù)，該技術(shù)將空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)正式推向單細胞分辨率時代。Visium HD空間基因表達玻片每個捕獲區(qū)域內(nèi)包含1100萬個2x2μm帶有空間位置標簽的小方格，小方格連續(xù)排列“無間隙”，實現(xiàn)全組織覆蓋，更加還原組織的空間結(jié)構(gòu)信息，獲得數(shù)據(jù)可根據(jù)不同細胞大小選擇合適的最小分析單位實現(xiàn)單細胞水平的空間組織結(jié)構(gòu)分析（10×官方推薦合并為8μm × 8μm，也可以根據(jù)細胞大小調(diào)整分析單位）。 基因表達玻片結(jié)構(gòu)
(4) Xenium-亞細胞水平的分辨率，真正的空間原位 10x Xenium是一款組織空間原位分析儀器，該儀器將單分子RNA檢測與強大的光學(xué)元件、數(shù)據(jù)采集和解碼技術(shù)相結(jié)合，能夠以亞細胞分辨率在整張切片上快速檢測RNA表達水平。該平臺可以兼容新鮮冷凍（FF）組織和石蠟包埋（FFPE）組織。用戶可以在多個預(yù)先設(shè)計好的基因 panel中進行選擇，也可以為人類和小鼠設(shè)計附加的自定義pannel或獨立的自定義pannel。 Xenium實驗原理介紹 樣本制備 將FF或FFPE組織切片置于Xenium載玻片上，對切片進行處理：FF樣本進行固定和透化、FFPE樣本進行脫蠟和解交聯(lián)； 探針雜交、連接與擴增 利用可環(huán)化的DNA探針與切片中互補的靶RNA雜交。過量的，未結(jié)合的探針在雜交后的清洗步驟中被沖走； 在去除未結(jié)合的探針后，添加一個連接酶將探針進行連接，并進行滾環(huán)式擴增； 進行自身熒光淬滅和DAPI染色； Xenium上機和解碼分析 組織原位的特異性擴增產(chǎn)物經(jīng)過多輪熒光探針雜交，成像和探針去除，形成原位熒光信號序列，儀器解碼這個熒光序列即可獲得該位置所屬基因。 實驗原理 總的來說，不管是單細胞轉(zhuǎn)錄組還是空間轉(zhuǎn)錄組，派森諾都有齊全的產(chǎn)品線滿足您的需求。目前派森諾開學(xué)季促銷活動正在火熱進行中，詳情請電話聯(lián)系我們或者聯(lián)系當?shù)劁N售。活動詳情：開學(xué)季，派森諾帶您解鎖單細胞奧秘 | 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)品大促，精準洞察生命的每一個瞬間！
