2024-07-18
前言 水稻是重要的主食和模式物種，大多數(shù)關(guān)于水稻分子景觀的研究都集中在RNA表達(dá)和表觀遺傳修飾上，早期對水稻蛋白質(zhì)組的研究只針對有限的組織，且儀器分辨率較低，大多缺乏準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量。2024年7月中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所等單位在Nature Plants（IF 15.8）上發(fā)表了題為Mass spectrometry-based proteomic landscape of rice reveals a post-transcriptional regulatory role of N6-methyladenosine的研究論文，描繪了水稻全景定量蛋白質(zhì)組圖譜，將有助于我們對水稻生物學(xué)和水稻組織生理功能機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
研究思路
研究結(jié)果展示 一、水稻組織定量蛋白質(zhì)組學(xué)景觀 對14種水稻組織（種子、根、莖、葉、雌蕊、花粉等）進(jìn)行TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖1a），在所有樣本中識(shí)別了15174個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)，鑒定了8964個(gè)UniProt數(shù)據(jù)庫中已記錄的蛋白質(zhì)（圖1b）。對相同的水稻樣本進(jìn)行了RNA測序（RNA-seq）分析，發(fā)現(xiàn)幾乎所有蛋白質(zhì)編碼基因（PCGs）都有mRNA水平的證據(jù)（圖1c）。在每個(gè)組織中，具有mRNA表達(dá)的基因數(shù)量約為蛋白質(zhì)表達(dá)的基因數(shù)量的兩倍（圖1d）。值得注意的是，缺乏蛋白質(zhì)證據(jù)的基因中有很大一部分表現(xiàn)出低水平的表達(dá)（圖1e），這表明轉(zhuǎn)錄本豐度較高的基因更傾向于被翻譯成蛋白質(zhì)。 圖1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜 二、組織富集蛋白和組織特異性蛋白 主成分分析（PCA）顯示蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)具有良好的可重復(fù)性（圖2a）。作者計(jì)算了每個(gè)組織中的相對蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)雌蕊蛋白質(zhì)組具有最豐富的組織性和組織特異性的蛋白質(zhì)，其次是花粉和根尖（圖2b）。對組織富集蛋白的功能富集分析揭示了與組織功能相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)過程和途徑。例如，胚胎發(fā)育相關(guān)蛋白在種子III中富集，而脂肪酸代謝過程相關(guān)蛋白在種子I中富集（圖2c）。對組織蛋白質(zhì)組進(jìn)行了兩兩交叉比較，發(fā)現(xiàn)生理和空間相關(guān)的組織在組織特異性蛋白中表現(xiàn)出交叉，如三個(gè)種子樣本之間、全根和根尖之間、花粉與成熟小穗之間交叉（圖2d）。亞細(xì)胞定位注釋分析顯示了各組織蛋白定位情況（圖2e），對光合組織和非光合組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，確定了672個(gè)在光合組織中高表達(dá)的核心蛋白（圖2f）。 圖2 跨水稻組織的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析 三、水稻和擬南芥蛋白質(zhì)組之間的保守特征 作者將5069對同源蛋白（占所有水稻擬南芥同源蛋白的56.5%）進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析來研究水稻和擬南芥蛋白質(zhì)組的異同（圖3a）。總體而言，相關(guān)分析和PCA分析顯示在如花粉、葉片、莖和雌蕊等許多相應(yīng)組織中，擬南芥和水稻之間的蛋白質(zhì)組普遍保守，而在其他組織中，種間蛋白質(zhì)組的保守程度較高（圖3b，c）。光合組織在相關(guān)圖和PCA圖中聚類，突出了單子葉水稻和雙子葉擬南芥之間的光合作用保護(hù)。盡管蛋白質(zhì)組表達(dá)的普遍保守，但也觀察到一些廣泛的差異。水稻和擬南芥的種子和成熟小穗蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組差異最為大（圖3b）。 圖3 擬南芥與水稻的蛋白質(zhì)組比較分析 四、RNA與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性 計(jì)算組織間蛋白質(zhì)-RNA相關(guān)性（圖4a），12896個(gè)基因中的5867個(gè)基因的蛋白質(zhì)水平與RNA水平呈顯著正相關(guān)，而大量基因（6838）無顯著相關(guān)，極少量基因（191）呈負(fù)相關(guān)（圖4b，c）。不同組織的相關(guān)系數(shù)不同，從成熟小穗的0.19到雌蕊的0.70（圖4d），說明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)合成機(jī)制可能對不同組織的蛋白質(zhì)豐度有不同的影響。采用蛋白質(zhì)-RNA比值（PTR）來評估蛋白質(zhì)和RNA水平的變化，組織間蛋白質(zhì)和RNA水平的變化與蛋白質(zhì)和RNA豐度無關(guān)，這表明蛋白質(zhì)和mRNA水平的組織特異性調(diào)控與它們的絕對豐度無關(guān)。然而，較高的PTR蛋白在不同組織中往往變化更大，這表明翻譯調(diào)控在塑造組織特異性蛋白質(zhì)組中起著重要作用（圖4e）。參與植物對氧化脅迫反應(yīng)和細(xì)胞壁組織的基因檢測到高PTRs（圖4f），這表明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有助于水稻和外刺激之間的相互作用。 圖4 水稻組織中蛋白質(zhì)豐度與RNA表達(dá)的相關(guān)性分析 五、跨水稻組織中m6 A修飾的圖譜 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是導(dǎo)致蛋白質(zhì)和RNA水平不一致的主要原因。最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾之一是RNA甲基化m6 A修飾，其在水稻中的分布和功能卻基本未知。為了探索m6 A在轉(zhuǎn)錄組中的動(dòng)態(tài)和分布，作者在14個(gè)組織中進(jìn)行了m6 A-seq2，m6 A峰優(yōu)先出現(xiàn)在3’非翻譯區(qū)（UTR）內(nèi)，且m6 A峰的分布模式在所有水稻組織中都是保守的（圖5d）。水稻中保守的m6 A峰的強(qiáng)度顯著高于非保守的m6 A峰（圖5f），保守的m6 A信號(hào)富集了參與翻譯調(diào)控活性和細(xì)胞定位的基因（圖5g）。檢測水稻中m6 A與基因表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)m6 A與mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。 圖5 水稻組織中的m6 A甲基組 六、UTR中m6 A修飾對翻譯產(chǎn)生負(fù)面影響 比較有m6 A和沒有m6 A的基因中RNA水平與蛋白質(zhì)豐度之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)有m6 A的基因中RNA和蛋白質(zhì)水平之間的相關(guān)性較弱（圖6a），分析m6 A水平對mRNA-蛋白相關(guān)性的影響，發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)（圖6b），分析了水稻組織中mRNA-蛋白的兩兩相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)有m6 A的基因的相關(guān)系數(shù)顯著低于沒有m6 A的基因（圖6c），這表明m6 A在決定RNA-蛋白不一致性中起著關(guān)鍵作用。為了確定m6 A的這種調(diào)控作用是否依賴于其在轉(zhuǎn)錄本中的位置，研究檢測了m6 A在不同轉(zhuǎn)錄本區(qū)域的位置，在5’UTR和/或3’UTR中含有m6 A的基因的PTRs顯著低于沒有m6 A的基因（圖6d），表明m6 A在水稻中具有翻譯抑制作用。利用水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)進(jìn)一步研究了m6 A的翻譯抑制功能。作者合成了由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和不驅(qū)動(dòng)m6 A基序的熒光素酶（LUC），并將其轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中。此外研究人員還對FTO進(jìn)行了共轉(zhuǎn)化，它編碼一種m6 A去甲基化酶（圖6e）。隨后，分析LUC蛋白活性和基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，有m6 A和沒有m6 A的LUC之間的蛋白水平具有可比性（圖6f）。有趣的是，含m6 A的LUC的表達(dá)量顯著高于不含m6 A或與FTO共表達(dá)的LUC（圖6g）。這些結(jié)果表明，LUC轉(zhuǎn)錄本上的m6 A抑制了mRNA的翻譯，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量降低。 圖6 m6A對水稻蛋白質(zhì)豐度貢獻(xiàn) 七、鑒定可能參與m6 A調(diào)控的潛在基因 通過對各種組織中的m6 A水平進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)了一些基因，它們可能是參與m6A甲基化的新調(diào)控因子，其蛋白水平與水稻各組織中m6A豐度相關(guān)。其中介導(dǎo)蛋白MED18與各組織的m6 A水平呈負(fù)相關(guān)（圖 7a），為了驗(yàn)證其在m6 A甲基化中的作用，利用CRISPR-Cas9生成了水稻 medl8 突變體（圖 7b），與野生型（WT）植株相比，突變株表現(xiàn)出相似的表型，根和芽都更短（圖7c-e）。LC-MS/MS分析顯示，med18突變體的m6 A水平顯著高于野生型（圖7f），表明med18對水稻m6 A甲基化有影響。基于medl8水稻突變體和WT植株，進(jìn)行TMT標(biāo)記的質(zhì)譜分析研究m6 A在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)豐度中的作用，分析了RNA表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組范圍的m6 A位點(diǎn)（圖7i）。med18-1中m6 A增加或增加的基因的PTR顯著降低，而med18-1中m6 A減少或缺失的基因的PTR顯著增加。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了m6 A對蛋白表達(dá)的負(fù)面影響。 圖7 MED18作為植物中新型m6 A調(diào)節(jié)因子的鑒定 總 結(jié) 該研究通過TMT蛋白質(zhì)組學(xué)量化了14種水稻組織中超過15000個(gè)基因的相對蛋白水平。鑒定了與單個(gè)組織的功能特異性相關(guān)的組織特異性和組織富集蛋白。水稻和擬南芥的蛋白質(zhì)基因組比較顯示出保守的蛋白質(zhì)組表達(dá)。值得注意的是，在水稻主要組織中對m6 A的分析表明，非翻譯區(qū)m6 A與蛋白質(zhì)豐度呈負(fù)相關(guān)，并導(dǎo)致RNA和蛋白質(zhì)水平的不一致。此研究為水稻蛋白質(zhì)基因組學(xué)的進(jìn)一步研究提供了一個(gè)范例。
參考文獻(xiàn)：Li ST, Ke Y, Zhu Y, et al. Mass spectrometry-based proteomic landscape of rice reveals a post-transcriptional regulatory role of N6-methyladenosine. Nat Plants. Published online July 12, 2024.
