2017-04-21
說到叢枝菌根真菌的研究，派森諾生物已積累了豐富的項目經(jīng)驗。在眾多項目合作過程中，我們發(fā)現(xiàn)不同的PCR擴增引物對叢枝菌根真菌群落的測序結(jié)果有很大的影響。小編今天要講解的這篇發(fā)表在微生態(tài)學(xué)老牌期刊《Environmental Microbiology》（最新影響因子5.932）上的論文，就對叢枝菌根真菌的兩對不同引物的擴增測序效果進行了全方位的比較和評估。
研究背景
真菌是土壤微生物中重要的組成部分，有些作為重要的環(huán)境物質(zhì)降解代謝菌，有些則是病原體，當(dāng)然也少不了植物菌根共生微生物，而其中叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）就是非常重要的一類微生物。AMF菌能與宿主植物互利共生，并為宿主提供氮、磷、硫源和水分，保護宿主免受病原體的侵害；作為回饋，宿主植物則將光合作用的產(chǎn)物以碳源的形式輸送給AMF菌。除此之外，AMF菌的多樣性是宿主植物多樣性的決定性因素之一。從2001年起，分類學(xué)上已將叢枝菌根真菌歸屬到Glomeromycota門下，其中包含Glomeromycetes綱以及Glomerales、Diversisporales、Archaeosporales和Paraglomerales目。鑒于AMF菌對宿主植物和土壤肥力的重要作用，運用高通量測序技術(shù)對AMF菌的多樣性組成譜進行研究也已越來越流行。
研究目的
本文旨在通過高通量測序的方法探究地中海生態(tài)系統(tǒng)中AMF菌的多樣性組成，并評估不同引物對于AMF群落多樣性組成譜測序結(jié)果的影響。
研究方法
測序技術(shù)：454 GS-FLX焦磷酸高通量測序平臺
測序模式：AMF微生物組18S rRNA測序
實驗對象：取自5個不同地點的25份土壤樣本
實驗設(shè)計：意大利撒丁島（地中海區(qū)域）北邊的丘陵主要富含五種土壤，分別為TV、CV、MM、PA、CO，每種土壤取5份土壤樣品，分別用兩對引物（AMV4.5NF/AMDGR和NS31/AMmix）進行擴增，得到50個擴增產(chǎn)物，對每種土壤的五份樣品擴增產(chǎn)物進行混樣，用最終得到的10個混合樣本進行高通量測序。
研究結(jié)果
通過對10個土壤樣本進行高通量測序，共獲得10924條序列，每樣本平均獲得1092條高質(zhì)量序列。其中引物AMV4.5NF/AMDGR擴增片段測序獲得6799條序列，而引物NS31/AMmix擴增片段測序獲得4125條序列。
在門水平，兩對引物所獲得測序數(shù)據(jù)量（絕對豐度和相對豐度）的比較。由圖中數(shù)據(jù)可知，引物AMV4.5NF/AMDGR擴增片段測序結(jié)果中所包含的Glomeromycota門絕對序列量和相對豐富都顯著大于引物NS31/AMmix擴增片段測序獲得Glomeromycota門的數(shù)據(jù)量。
兩種不同引物測序所獲得的五種不同土壤樣品中，含有的Glomeromycota門數(shù)據(jù)量，引物AMV4.5NF/AMDGR所獲得的數(shù)據(jù)量都明顯高于另一對應(yīng)物，并且在PA土壤中兩對引物所獲得的數(shù)據(jù)量都是最多的，而在CO土壤中則是最少的。
分別在相似度為80%、85%、95%、97%的條件下，對AMF菌測序所得序列劃分OTU，并繪制稀疏曲線。由圖可知，97%的閾值下劃分所得OTU數(shù)最多，但兩對引物在相同的閾值條件下，劃分所得OTU數(shù)差別很大；而通過ACE和Chao1指數(shù)預(yù)估的群落中OTU總數(shù)顯著多于97%閾值下劃分所得OTU數(shù)。
由OTU的豐度等級曲線可知，在97%的相似度下，序列都集中于少數(shù)高豐度OTU中。
將測序所得Glomeromycota門中4個目的測序序列數(shù)和97%閾值下劃分所得OTU數(shù)進行比較分析，由餅圖可知，雖然兩對引物測序所得總數(shù)據(jù)量不同，但是其中所含Glomeromycota門中4個目的相對豐度是較為一致的；由OTU和數(shù)據(jù)量的絕對豐度和相對豐度柱狀圖可知，不同土壤樣品中所含OTU數(shù)和測序序列數(shù)的分布也是一致的。
OTU維恩圖分析顯示，引物AMV4.5NF/AMDGR測序結(jié)果中，有11個OTU存在于五種不同土壤中，其中9個屬于Glomerales目，2個屬于Diversisporales目；引物NS31/AMmix測序結(jié)果中，五種土壤只共有1個OTU屬于Glomerales目；對五種土壤（引物AMV4.5NF/AMDGR）測序結(jié)果進行Jaccard相似指數(shù)分析，由表可知，土壤TV和PA、TV和CV之間AMF菌群組成結(jié)構(gòu)的相似性最高。
總結(jié)
本研究對意大利撒丁島（地中海區(qū)域）北邊的丘陵中主要富含的五種土壤進行高通量測序，從而研究AMF菌群的多樣性組成譜。本研究的一個顯著特點在于，使用了兩對不同的引物對土壤樣品進行擴增測序，而對兩對引物的測序結(jié)果進行分析對比可知，引物AMV4.5NF/AMDGR更適用于AMF菌的高通量測序，為關(guān)注AMF菌多樣性組成的眾多研究人員提供了更加科學(xué)靠譜的引物選擇依據(jù)！
文末福利
值得一提的是，上述文獻中的兩對引物的擴增片段長度都在200~300 bp之間，都可以用Illumina超高通量的測序技術(shù)進行測序分析哦！
另外，除了引物選擇，AMF菌群的測序分析還有一個關(guān)鍵點，那就是使用MaarjAM（http://www.maarjam.botany.ut.ee/）數(shù)據(jù)庫進行物種注釋！派森諾生物已將MaarjAM數(shù)據(jù)庫整合于AMF菌群的多樣性組成譜標(biāo)準(zhǔn)分析流程，歡迎各位新老客戶來嘗試哦！
文章索引：
Lumini, E., Orgiazzi, A., Borriello, R., Bonfante, P. & Bianciotto, V.Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a pyrosequencing approach. Environ. Microbiol.12,165–2179 (2010).
點擊鏈接，閱讀原文：http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1462-2920.2009.02099.x/abstract
