2024-07-12
單細胞測序技術自2009年問世，2013年被Nature Methods評為年度技術以來，越來越多地被應用在科研領域。2015年以來，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技術的出現，徹底降低了單細胞測序的成本門檻。自此，單細胞測序技術被廣泛應用于基礎科研和臨床研究，單細胞在許多領域都占有一席之地，對于癌癥早期的診斷、追蹤以及個體化治療具有重要意義。近些年來，隨著單細胞測序技術測序通量的提高以及測序成本的降低，單細胞測序技術在醫藥、農學、水產等各個領域均有著廣泛的研究，下面通過4篇文獻來助您打開單細胞測序在免疫學研究中的應用思路~
研究背景 由于胰腺導管腺癌（PDAC）對包括免疫檢查點封鎖在內的治療方法表現出耐藥性，因此患者的預后仍然很嚴峻。有趣的是，微生物群似乎會影響 PDAC 的結果。在長期的 PDAC 幸存者中，微生物組多樣性的增加與腫瘤微環境（TME）的生存率和免疫學特征相關。此外，在小鼠模型中，來自長期存活者的糞便微生物群移植（FMT）減少了腫瘤大小，而來自短期存活者的 FMT（STS）導致腫瘤增大和 CD4+ FOXP3+ T 細胞的增加。以往研究表明，一種免疫學上重要的細菌代謝物—吲哚，可通過激活轉錄調節因子 AhR 來調控 T 細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞的功能，從而抑制炎癥。巨噬細胞是 PDAC 免疫浸潤的主要組成部分。而且 AhR 在髓系細胞中的表達更高，這提示著或許髓系細胞具有對 AhR 配體更高的敏感性。 研究材料 本研究先對 PDAC 腫瘤內巨噬細胞、組織內巨噬細胞進行 bulk 轉錄組檢測。然后對腫瘤移植 14 天后的 PDAC AhR 缺失小鼠和 PDAC 正常小鼠的腫瘤樣本進行 scRNA-seq 測序（n=3）。同時還對腫瘤小鼠的腸道內容物進行 16S 測序，對灌胃處理的 C57BL/6J 小鼠胃腸道進行靶向代謝組檢測。 研究思路 研究結果 作者通過 scRNA-seq 結合 16s 和靶向代謝組測序研究了 AhR 對 PDAC 中腫瘤相關巨噬細胞 (TAM) 功能的影響。TAMs 表現出高 AhR 活性，AhR 缺失的巨噬細胞表現出炎癥表型。髓系細胞中 Ahr 的缺失或 Ahr 的藥理學抑制降低了 PDAC 的生長，提高了免疫檢查點阻斷的效果，增加了 IFNγ+CD8+ T 細胞的腫瘤內頻率（圖 1）。研究者發現乳桿菌將膳食中的色氨酸代謝為吲哚并激活巨噬細胞 AhR 活性。去除膳食色氨酸可降低 TAM 的 AhR 活性，促進腫瘤內 TNFα+IFNγ+CD8+ T 細胞的聚集；在膳食中添加吲哚可以阻斷這種作用。并且，在 PDAC 患者中，高 AHR表達與快速疾病進展和死亡率以及免疫抑制 TAM 表型相關，這表明該調節軸在人類疾病中具有保守性。 圖 1：scRNA-seq 揭示巨噬細胞 AhR 重塑 PDAC 中的轉錄過程 原文索引 Deng G, Zhou L, Wang B, et al. Targeting cathepsin B by cycloastragenol enhances antitumor immunity of CD8 T cells via inhibiting MHC-I degradation. J Immunother Cancer. 2022;10(10):e004874. doi:10.1136/jitc-2022-004874
研究背景 近年來，癌癥免疫療法蓬勃發展，其中，嵌合抗原受體（ chimeric antigen receptor，CAR）T 細胞療法是突破性技術之一。該方法在白血病和淋巴瘤的治療上卓有成效。但在實體腫瘤中，CAR-T 治療還面臨兩個關鍵挑戰：1）腫瘤本身存在抗原異質性，即不是所有的腫瘤細胞都表達 CAR 靶向的抗原；2）在治療過程中發生的抗原丟失，即腫瘤細胞在受到 CAR T 細胞的攻擊時，一些腫瘤細胞的反應是停止靶抗原的產生。本文作者之前發現，給小鼠注射 CAR-T 細胞后不久后，繼續注射攜帶 CAR-T 細胞靶向的相同抗原的疫苗直接在原生淋巴結微環境中重新刺激 CAR - T 細胞可以有助于 CAR-T 細胞攻擊腫瘤，而且還有助于產生針對其他腫瘤抗原的宿主 T 細胞，即發生抗原擴散效應（Antigen spreading，AS）。因此，本次研究作者主要想進一步探究 AS的作用機制。 研究材料 本研究對小鼠膠質母細胞瘤模型分別進行 CD45.1+CAR-T和CD45.1CAR-T+Vax（CAR-T+ 疫苗）治療，在治療后的第 7 天和第14天分別取腫瘤組織解離為單細胞懸液并分選CD45.2+ CD4 和 CD8 T 細胞進行單細胞轉錄組和免疫組庫測序。 研究思路 研究結果 作者發現疫苗增強 CAR-T 細胞會觸發內源性免疫系統的參與，以規避抗原陰性的腫瘤逃逸。因此，作者使用這種 CAR-T 治療聯合疫苗增強作為模型，結合單細胞轉錄組測序及其他驗證手段，來了解 AS 效應在 CAR-T 清除具有抗原異質性實體瘤中的作用機制。結果發現，疫苗增強的 CAR-T 可以促進樹突狀細胞（DC）向腫瘤的募集，增加DC 對腫瘤抗原的攝取，并誘導內源性抗腫瘤 T 細胞的啟動。這一過程伴隨著 CAR-T 代謝向氧化磷酸化（OXPHOS）的轉變，并嚴重依賴于 CAR-T 衍生的 IFN-γ（圖 1）。疫苗增強的 CAR-T 誘導的抗原擴散效應（AS）可以有效應對實體瘤的抗原丟失現象，增強 CAR-T 表達 IFN-γ 的能力可以進一步增強異質性腫瘤的治療效果。因此，CAR-T 細胞來源的 IFN-γ 在促進 AS 中起著關鍵作用，這一組合療法有望成為治療實體瘤的有效手段（圖 2）。 原文索引 Ma L, Hostetler A, Morgan DM, et al. Vaccine-boosted CAR T crosstalk with host immunity to reject tumors with antigen heterogeneity. Cell. 2023;186(15):3148-3165.e20. doi:10.1016/j.cell.2023.06.002
研究背景 超過 2.8 億人患有慢性 HBV 感染（Chronic HBV, CHB），并且處于發展為肝硬化、肝功能衰竭或肝細胞癌 (HCC) 的高風險中，這導致每年超過 700000 人死亡。目前，臨床上用于 CHB 治療的藥物主要包括干擾素和核苷（酸）類似物（NAs），抗病毒治療能夠有效抑制病毒復制，但僅極少數患者可以實現“功能性治愈”，大量 CHB 患者需長期乃至終身抗病毒治療。受限于肝臟樣本可及性及傳統研究技術手段，既往 HBV 感染相關臨床轉化研究大多使用外周血樣本，但仍然缺乏使用 scRNA-seq 對 HBV 感染的肝臟原位免疫反應的全面視圖。 研究材料 乙肝感染不同階段患者（包括免疫耐受期—IT，n=6；免疫活化期—IA，n=5；急性感染恢復期—AR，n=3；慢性感染治愈患者—CR，n=3）和健康肝移植供者（HC，n=6）作為對照，取外周血和肝臟穿刺組織的 CD45+ 免疫細胞做單細胞轉錄組和單細胞免疫組庫測序。 研究思路 研究結果 作者通過單細胞轉錄組測序構建易感患者肝臟和外周免疫圖譜（圖 1），并發現：1）耗竭 CD8+ T 細胞（Tex）在 IT、IA 和 AR 組肝臟中增多，其中 IA 和 AR 的增加幅度更大且呈現更顯著的耗竭相關轉錄特征。IA 和 AR 患者中耗盡的 CD8+T 細胞的來源不同，CD8+T 細胞在肝臟和血液之間的轉移可能促進病毒清除，表明影響 CD8+T 細胞功能和分化的因素在 HBV 感染中的重要作用；2）發現 IT 和 IA 階段，Treg(CD4T_C09-CTLA4) 和 Tex(CD8T_C08-LAYN) 之間存在顯著的交互作用；3）FCGR3A+ 巨噬細胞可能通過 HLA-I_LILRB 信號傳導在調節慢性感染期T 細胞應答中起著關鍵作用，Tex、Treg 和 FCGR3A+ 巨噬細胞亞群之間在 IT 和 IA 期表現出強烈的相互作用；4）IA 和 AR 患者的 T 細胞的功能紊亂與患者的肝組織損傷程度密切相關。 圖 1：肝臟和血液中免疫細胞的單細胞轉錄組圖譜 原文索引 Zhang C, Li J, Cheng Y, et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients. Gut. 2023;72(1):153-167. doi:10.1136/gutjnl-2021-325915
研究背景 甲狀腺相關性眼?。═AO）是以眼球后及眶周組織的浸潤性病變為特征的器官特異自身免疫性疾病，是甲狀腺疾病最常見的甲狀腺外表現之一。TAO常表現為突眼、眼瞼退縮、復視等，嚴重者甚至會危及視力，導致失明。TAO涉及的主要過程是眶周組織中的炎癥、糖胺聚糖積累、脂肪生成和肌纖維形成。由于目前于對其發病機制知之甚少，TAO的治療仍然具有挑戰性，因此，深入解析TAO眼眶結締組織的免疫微環境，有望為進一步闡明TAO發病機制和找到潛在的治療靶點提供分子依據。 研究材料 取10名接受眶減壓手術的TAO患者與10名接受眼瞼整形術的正常對照的眼眶結締組織進行單細胞轉錄測序。 研究思路 研究結果 作者通過對甲狀腺相關性眼病（TAO）患者和正常對照的眼眶結締組織進行單細胞轉錄組測序，構建了 TAO 眼眶結締組織的單細胞圖譜（圖 1），發現高表達 RASD1 的成脂分化成纖維細胞高度參與脂肪生成和炎癥，ACKR1 + 內皮細胞有助于 TAO 中的炎癥細胞浸潤，脂肪組織巨噬細胞參與 TAO 中的脂質代謝和炎癥反應，同時終末分化CD8+CTL 細胞也是眼眶組織干擾素的分泌來源之一（圖 2）。該研究拓展了對 TAO 眼眶組織免疫微環境的認識，為探索 TAO 的潛在治療靶點提供了新的思路。 原文索引 Li Z, Wang M, Tan J, et al. Single-cell RNA sequencing depicts the local cell landscape in thyroid-associated ophthalmopathy. Cell Rep Med. 2022;3(8):100699. doi:10.1016/j.xcrm.2022.100699
