2024-07-06
前言 5mC(5-甲基胞嘧啶)和5hmC(羥甲基胞嘧啶)是基因組DNA中最常見且在表觀遺傳調(diào)控中扮演重要角色的兩種修飾形式。一般通過塑造染色質(zhì)狀態(tài)、影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方式調(diào)控基因表達(dá)，引起細(xì)胞表型和功能上的變化，在細(xì)胞分化、發(fā)育及疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)解析基因組DNA上5mC和5hmC的分布和動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)是研究DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化的功能及其調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。但是目前沒有在單細(xì)胞水平上解析5mC和5hmC的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
PART01、技術(shù)路線 北京大學(xué)伊成器及康奈爾大學(xué)朱晨旭共同通訊在Nature Biotechnology上發(fā)表題為“Simultaneous single-cell analysis of 5mC and 5hmC with SIMPLE-seq”的文獻(xiàn)，該研究提出了一種在單細(xì)胞、單分子水平上同時(shí)檢測5mC和5hmC的測序技術(shù)—SIMPLE-seq。該技術(shù)使用兩個(gè)正交標(biāo)記步驟將靶向修飾(5mC和5hmC）轉(zhuǎn)化為兩種胸腺嘧啶(T)類似物，在每個(gè)標(biāo)記步驟之后，利用DNA聚合酶延伸反應(yīng)記錄轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的堿基突變信號(5mC-to-T，5hmC-to-T)。同時(shí)引入帶有修飾堿基的標(biāo)記序列并利用其伴隨（C-to-T）產(chǎn)生的突變信號對5mC和5hmC的突變信息進(jìn)行拆分，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測同一條DNA分子上的5mC和5hmC。為了區(qū)分來自兩個(gè)標(biāo)記反應(yīng)的突變信號，使用具有指示序列的特殊引物：來自5hmC標(biāo)記步驟的延伸產(chǎn)物將進(jìn)行第二次5mC標(biāo)記反應(yīng)以產(chǎn)生突變的指示序列；相反源自5mC標(biāo)記的產(chǎn)品保留了原始指示序列。除此之外，研究團(tuán)隊(duì)將該流程與細(xì)胞組合標(biāo)簽技術(shù)相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)高通量、單細(xì)胞、全基因組水平的5mC和5hmC測序，如圖1所示。 圖1 SIMPLE-seq實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理圖
PART02、性能驗(yàn)證 作者首先將SIMPLE-seq技術(shù)應(yīng)用于研究不同干性培養(yǎng)條件下小鼠胚胎干細(xì)胞的表觀圖譜差異，在單分子水平上鑒定了5mC和5hmC的分布關(guān)系，解析了兩種干細(xì)胞狀態(tài)下DNA表觀遺傳圖譜的重編程變化，如圖2所示。觀察到來自一致和不一致基序組的相似數(shù)量的TFs與TF基因表達(dá)水平呈正負(fù)相關(guān)，表明5mC和5hmC對TF結(jié)合和調(diào)控輸出的明顯而復(fù)雜的影響。除此之外發(fā)現(xiàn)這兩組的小鼠胚胎干細(xì)胞在5hmC上比在5mC上可以更明顯地相互分離，同時(shí)這種細(xì)胞間5mC和5hmC的明顯異質(zhì)性促使我們分析單細(xì)胞中5mC-5hmC的關(guān)系。最終揭示了與活性染色質(zhì)相關(guān)的多種5hmC類型，同時(shí)也表明了SIMPLE-seq在揭示小鼠胚胎干細(xì)胞的不同狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中與不同調(diào)節(jié)功能相關(guān)的不同5hmC類型的效果。 圖2 同一分子的5mC和5hmC的分析結(jié)果 除此之外，作者還將SIMPLE-seq技術(shù)應(yīng)用于分析細(xì)胞組成復(fù)雜的組織樣本，包括繪制了約3000個(gè)人外周血單個(gè)核細(xì)胞以及6000個(gè)小鼠大腦皮層細(xì)胞的DNA甲基化和羥甲基化圖譜，如圖3和圖4所示。作者結(jié)合兩類表觀遺傳修飾鑒定得到精確的細(xì)胞分型結(jié)果，探究了5mC和5hmC與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白修飾、基因表達(dá)等其他組學(xué)之間的關(guān)系，展示了SIMPLE-seq在多種復(fù)雜生物學(xué)樣本中鑒定不同細(xì)胞類型和狀態(tài)的能力，體現(xiàn)了DNA甲基化和羥甲基化聯(lián)合分析的巨大潛力和廣泛應(yīng)用場景。 圖3 人PBMC中細(xì)胞類型特異性的5mC和5hmC圖譜 圖4 小鼠腦5mC和5hmC的單細(xì)胞圖譜
綜上所述, SIMPLE-seq是一種在單細(xì)胞、單分子水平上同時(shí)檢測基因組DNA甲基化和羥甲基化的新技術(shù), 可以在復(fù)雜生物學(xué)樣本和復(fù)雜生物學(xué)過程中檢測多種細(xì)胞類型的基因組DNA表觀遺傳修飾的全景圖譜。除此之外，可進(jìn)一步與轉(zhuǎn)錄組、組蛋白修飾、染色質(zhì)可及性或染色體構(gòu)象分析相結(jié)合，以擴(kuò)大綜合細(xì)胞分析的范圍。
