機(jī)制研究難？機(jī)制研究無(wú)從下手？機(jī)制研究后續(xù)如何開(kāi)展？本篇文章將帶大家走入微生物的世界，一起來(lái)看看蛋白質(zhì)組學(xué)如何發(fā)光發(fā)熱拯救微生物機(jī)制研究吧！
微生物存在于世界每個(gè)角落，具有分布廣、種類(lèi)多的特性。對(duì)于微生物的研究目前大多通過(guò)宏基因組和代謝組學(xué)聯(lián)合去解析微生物的群落分布、功能情況。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為微生物的機(jī)制研究提供了另外的參考角度。針對(duì)特定微生物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制研究在深化生命科學(xué)研究、促進(jìn)醫(yī)療健康、推動(dòng)藥物研發(fā)、保護(hù)環(huán)境和提升農(nóng)業(yè)科技等多個(gè)領(lǐng)域都具有重要意義。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，我們可以更深入地了解某些特定微生物的生理功能和代謝途徑，為相關(guān)領(lǐng)域的研究和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供有力支持。
圖1微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究整體思路圖
微生物蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制研究思路整體可以清晰地分為以下幾個(gè)步驟：
1、確定研究目標(biāo)與對(duì)象：明確需要要解決的生物學(xué)問(wèn)題，例如微生物的致病機(jī)制、適應(yīng)機(jī)制、毒力因子等。
2、選擇合適的樣本類(lèi)型和技術(shù)手段：表征不同變量條件下表型和生理指標(biāo)的變化，并以單一蛋白質(zhì)學(xué)或者多組學(xué)實(shí)驗(yàn)為出發(fā)點(diǎn)對(duì)樣本中的基因或者蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)。
3、根據(jù)研究目的對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進(jìn)生信分析和篩選，選定相關(guān)的特征分子，并進(jìn)行PRM靶向靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證。
4、利用酵母雙雜交或免疫共沉淀對(duì)特征分子進(jìn)行互作蛋白確認(rèn)，并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)探究其影響的上下游蛋白和通路。構(gòu)建敲除或過(guò)表達(dá)的突變體等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)特征分子進(jìn)行功能探索和驗(yàn)證。
在今天的分享環(huán)節(jié)，將向大家展示如何利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入探究特定微生物的機(jī)制，并介紹其在植物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及工業(yè)和食品等多個(gè)領(lǐng)域所取得的高水平研究成果。
稻瘟病菌發(fā)育過(guò)程機(jī)制探索
標(biāo)題：The phosphorylation landscape of infection-related development by the rice blast fungus
發(fā)表時(shí)間：2024年5月9日
發(fā)表期刊：cell（IF:64）
發(fā)表單位：英國(guó)塞恩斯伯里實(shí)驗(yàn)室
主要技術(shù)手段：磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)、PRM靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)、酵母雙雜交、免疫共沉淀
研究背景：
水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae通常會(huì)發(fā)育出一個(gè)黑色素沉著的附著胞，使病原體能夠穿透植物葉片表皮，引起病害，對(duì)全球糧食種植產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了巨大威脅。以往研究表明附著胞形態(tài)發(fā)生需要一個(gè)MAPK信號(hào)通路，其中病原性絲裂原活化蛋白激酶1（Pmk1）MAPK是核心組成部分。然而，這些下游Pmk1信號(hào)組分如何調(diào)節(jié)稻瘟病感染的分子機(jī)制仍然未知。
研究思路
（1）觀察野生型和Pmk1突變型稻瘟病菌附著孢子隨定植時(shí)間增加的表型和指標(biāo)變化；
（2）LFQ磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)探究突變菌和野生菌隨定植時(shí)間變化的蛋白情況；
（3）不同真菌磷酸化保守程度研究；
（4）PRM靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證Pmk1下游靶標(biāo)；
（5）酵母雙雜交和免疫共沉淀鎖定核心分子Vts1；
（6）構(gòu)建位點(diǎn)突變和質(zhì)譜靶向驗(yàn)證Pmk1影響Vts1生物功能和位點(diǎn)；
圖2 稻瘟病菌發(fā)育過(guò)程機(jī)制思路圖
結(jié)果速覽：研究人員以稻瘟病菌分生孢子為研究對(duì)象，基于LFQ磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（LC-MS/MS）分析了稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）感染相關(guān)的發(fā)展情況，探索了定植過(guò)程附著孢Pmk1依賴的分子機(jī)制，結(jié)果顯示在疏水表面發(fā)芽后發(fā)現(xiàn)了2062個(gè)真菌蛋白上的8005個(gè)磷酸位點(diǎn)，揭示了附著胞發(fā)育過(guò)程中磷酸化信號(hào)級(jí)聯(lián)的重大重塑。比較了41種不同致病機(jī)理的真菌病原的保守性磷酸化位點(diǎn)圖譜。然后，使用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）來(lái)鑒真菌感染植物Pmk1 MAPK調(diào)節(jié)的磷蛋白，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)鑒定并驗(yàn)證了Pmk1的關(guān)鍵靶標(biāo)Vts1及其作用機(jī)制。
圖3 稻瘟病菌致病機(jī)制部分結(jié)果圖
益生菌宿主互作調(diào)節(jié)腸道健康機(jī)制探索
標(biāo)題：The secreted protein Amuc_1409 from Akkermansia muciniphila improves gut health through intestinal stem cell regulation
發(fā)表時(shí)間：2024年4月6日
發(fā)表期刊：Nature Communications（IF:16.6）
發(fā)表單位：韓國(guó)生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所
主要技術(shù)手段：分泌蛋白組、免疫組化、qRT-PCR、免疫共沉淀
研究背景：
Akkermansia muciniphila是腸道微生物群中最豐富的成員之一，越來(lái)越多的證據(jù)支持其對(duì)維持腸道健康和改善炎癥以及改善肥胖、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和相關(guān)并發(fā)癥的有益作用。其衍生的生物活性分子具有靶向信號(hào)通路的潛在能力。因此，需要進(jìn)一步的研究來(lái)了解宿主和A. muciniphila之間的相互作用。
研究思路：
（1）分泌蛋白組發(fā)現(xiàn)Amuc_1409是A. muciniphila分泌中最常見(jiàn)的蛋白；
（2）Amuc_1409通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)ISC介導(dǎo)的腸類(lèi)器官上皮發(fā)育；
（3）Amuc_1409通過(guò)促進(jìn)ISC介導(dǎo)的再生來(lái)保護(hù)輻照或5-FU誘導(dǎo)的腸道損傷；
（4）Amuc_1409恢復(fù)老化過(guò)程中ISCs的數(shù)量和功能；
（5）Amuc_1409通過(guò)與E-cadherin相互作用促進(jìn)E-cadherin/β-catenin復(fù)合物解離，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路；
（6） Amuc_1409以E-cadherin依賴的方式直接促進(jìn)ISCs的再生功能；
研究思路圖
圖4菌株關(guān)鍵因子調(diào)節(jié)腸道健康思路圖
結(jié)果速覽：此研究旨在鑒定嗜粘液芽孢桿菌中新的益生菌相關(guān)效應(yīng)分子，并確定其功能。首先通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)條件下的上清進(jìn)行分泌蛋白組質(zhì)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)假定效應(yīng)因子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Amuc_1409，通過(guò)體外腸道模型和動(dòng)物模型探索了Amuc_1409治療體內(nèi)放射或化療藥物誘導(dǎo)的腸道損傷和自然衰老過(guò)程種中增加了腸道干細(xì)胞(ISC)的增殖和再生。機(jī)制上，通過(guò)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Amuc_1409通過(guò)與E-cadherin相互作用促進(jìn)E-cadherin/β-catenin復(fù)合物解離，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，是一種有希望改善和維持腸道健康的生物分子。
圖5 菌株關(guān)鍵因子調(diào)節(jié)腸道健康部分結(jié)果圖
硝酸鹽調(diào)節(jié)微生物表面活性素過(guò)量生產(chǎn)的機(jī)制
標(biāo)題：Enhancing surfactin production in Bacillus subtilis: Insights from proteomic analysis of nitrate-induced overproduction and strategies for combinatorial metabolic engineering
發(fā)表時(shí)間：2024年2月27日
發(fā)表期刊：Bioresource Technology ( IF 11.4 )
發(fā)表單位：天津大學(xué)
主要技術(shù)手段：蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝工程
研究背景：表面活性素是一種脂肽類(lèi)生物表面活性劑，主要由芽孢桿菌合成。由于其具有降低溶液表面張力、生物可降解性和抗菌活性等優(yōu)點(diǎn)，該化合物在農(nóng)業(yè)和環(huán)境治理中具有巨大的應(yīng)用潛力。近年來(lái)，有研究通過(guò)微生物發(fā)酵優(yōu)化和菌株改良增加了surfactin的產(chǎn)量，但surfactin產(chǎn)量仍有較大的提升空間。從蛋白質(zhì)組學(xué)出發(fā)解析特定條件的改良對(duì)產(chǎn)量提升機(jī)制有非常重要的意義。
研究思路：
（1）探索枯草芽孢桿菌不同的發(fā)酵環(huán)境條件對(duì)surfactin生產(chǎn)的影響；
（2）蛋白質(zhì)組學(xué)分析篩查surfactin代謝相關(guān)蛋白；
（3）使用P43啟動(dòng)子對(duì)候選靶點(diǎn)(narG、narH和cypC)進(jìn)行過(guò)表達(dá)，產(chǎn)量提升，增強(qiáng)硝酸鹽的還原代謝和脂肪酸底物的羥基化作用；
（4）使用P43啟動(dòng)子分別過(guò)表達(dá)SecA、FtsY和FtsE，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SecA、FtsY和FtsE）的聯(lián)合過(guò)表達(dá)大幅提高了表面活性素的產(chǎn)量；
（5）投喂外源性飼料（膜轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)物質(zhì)（海藻糖）、碳相關(guān)代謝物（半乳糖和丙酮酸）和脂肪酸相關(guān)代謝的特定物質(zhì)（醋酸鈉和油酸）以提高表面活性素的產(chǎn)量；
圖6硝酸鹽調(diào)節(jié)微生物surfactin產(chǎn)量研究思路圖
結(jié)果速覽：研究人員發(fā)現(xiàn)添加氮源（硝酸鹽）提高了枯草芽孢桿菌的表面活性素的產(chǎn)量。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了硝酸鹽誘導(dǎo)表面活性素過(guò)量產(chǎn)生的機(jī)制，確定了與表面活性素轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控相關(guān)的三個(gè)關(guān)鍵差異蛋白（前蛋白轉(zhuǎn)位酶亞基SecA、信號(hào)識(shí)別粒子受體FtsY和細(xì)胞分裂三磷酸腺苷結(jié)合蛋白FtsE）。通過(guò)組合代謝工程策略構(gòu)建的工程菌株（增強(qiáng)硝酸鹽還原、脂肪酸羥基化、合理轉(zhuǎn)運(yùn)體工程和喂養(yǎng)）與野生型菌株相比，表面活性素的產(chǎn)量增加了41.4倍。這項(xiàng)研究提供了硝酸鹽誘導(dǎo)表面活性素過(guò)量生產(chǎn)的分子機(jī)制以及提高活性素產(chǎn)生菌株性能的策略。
圖7硝酸鹽調(diào)節(jié)微生物surfactin產(chǎn)量部分結(jié)果圖
食品添加劑抑制病原菌生長(zhǎng)機(jī)制
標(biāo)題：Integration analysis of transcriptomics and proteomics reveals the inhibitory effect of carvacrol on Alternaria alternata by interfering with carbohydrate metabolism
發(fā)表時(shí)間：2024年4月09日
發(fā)表期刊：Postharvest Biology and Technology (IF 7.0)
發(fā)表單位：北方民族大學(xué)
主要技術(shù)手段：透射電鏡、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、PRM靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)
研究背景：真菌感染是水果和蔬菜收獲后變質(zhì)的主要原因，香芹酚（CVR）在體外具有抗真菌特性，CVR處理可以抑制細(xì)胞壁多糖的合成以及幾丁質(zhì)和葡聚糖的代謝，從而抑制鏈格孢菌的生長(zhǎng)，已被批準(zhǔn)為安全的食品添加劑。破壞碳水化合物的生物合成是開(kāi)發(fā)新型治療劑的一種有前途且高度特異性的方法，然而，目前尚不清楚CVR處理對(duì)鏈格孢菌整體碳水化合物代謝的影響機(jī)制。
研究思路：
（1）電鏡觀察CVR降低了鏈格孢菌的糖原儲(chǔ)存、幾丁質(zhì)分布和細(xì)胞壁厚度；
（2）探究CVR對(duì)鏈格孢菌含糖量的影響；
（3）蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)和生信分析發(fā)現(xiàn)碳水化合物代謝在真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活中起著至關(guān)重要的作用；
（4）PRM蛋白質(zhì)組學(xué)和qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)情況；
（5）蛋白代謝聯(lián)合分析解析CVR對(duì)菌絲體碳水化合物代謝影響的分子機(jī)制；
（6）測(cè)試CVR處理降低了鏈格孢菌對(duì)纖維素、蔗糖、淀粉和果膠的利用能力；
圖8 食品添加劑抑制病原菌生長(zhǎng)機(jī)制思路圖
結(jié)果速覽：研究者發(fā)現(xiàn)CVR處理降低了鏈格孢菌的細(xì)胞壁厚度、幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖分布、糖原積累以及總糖、三鹵糖、甘露糖、果糖和半乳糖含量。蛋白質(zhì)組分析表明，CVR處理加速了鏈格孢菌細(xì)胞壁多糖的分解，阻礙了蔗糖的消耗，破壞了糖酵解途徑，并促進(jìn)了與抗逆性相關(guān)的碳水化合物的分解。此外，碳源培養(yǎng)的結(jié)果表明，CVR會(huì)影響碳水化合物的代謝，而碳水化合物的代謝與鏈格孢菌的生長(zhǎng)、感染和抗逆性有關(guān)。
圖9食品添加劑抑制病原菌生長(zhǎng)機(jī)制部分結(jié)果圖
參考文獻(xiàn)：
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2.Kang EJ, Kim JH, Kim YE, et al. The secreted protein Amuc_1409 from Akkermansia muciniphila improves gut health through intestinal stem cell regulation. Nat Commun. 2024;15(1):2983. Published 2024 Apr 6. doi:10.1038/s41467-024-47275-8
3.Xia L, Hou Z, Zhu F, Wen J. Enhancing surfactin production in Bacillus subtilis: Insights from proteomic analysis of nitrate-induced overproduction and strategies for combinatorial metabolic engineering. Bioresour Technol. 2024;397:130499. doi:10.1016/j.biortech.2024.130499
4.Zhao L, Wang J J, Zhang H Y, et al. Integration analysis of transcriptomics and proteomics reveals the inhibitory effect of carvacrol on Alternaria alternata by interfering with carbohydrate metabolism[J]. Postharvest Biology and Technology, 2024; 213, 112928. doi:10.1016/j.postharvbio.2024.112928.
