1. 研究背景
家山黧豆，作為人類的食物及動(dòng)物的飼料，最早可追溯到新石器時(shí)代。長(zhǎng)期以來，因其營養(yǎng)豐富，具有耐旱、耐澇、耐寒等優(yōu)良生產(chǎn)性狀,廣受世界各地的青睞。特別是在大旱年份，在其它糧食作物絕收的情況下，仍有較好的收成，因此，被視為干旱及半干旱地區(qū)首選的優(yōu)良作物，但由于其擁有較大的基因組（8.2Gb），易發(fā)生外交，并且含有神經(jīng)細(xì)胞毒性物質(zhì)L-β-L-酰二氨基丙酸（ODAP），過量食用會(huì)引起下肢痙攣性癱瘓等原因，使家山黧豆的種植受到限制。目前國內(nèi)外對(duì)于該種作物的研究也較少。可喜的是，今年（2017年）10月在Frontier in Plant Science（IF = 4.298）這一期刊上發(fā)表了一篇關(guān)于家山黧豆的文章。這篇文章主要是通過Illumina NextSeqTM 500測(cè)序平臺(tái)從基因?qū)用鎭斫议_家山黧豆的神秘面紗。
2. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
2.1 對(duì)非洲和歐洲的家山黧豆幼苗期的根，莖和葉的混合樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
表1 trinity軟件對(duì)家山黧豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的de novo組裝
圖1 家山黧豆unigene的Nr, GO, KEGG, eggNOG, Swissport 數(shù)據(jù)庫的注釋分布
如表1所示，家山黧豆測(cè)得142053個(gè)轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)過拼接得到27431個(gè)Unigene。這27431個(gè)Unigene分別和NR，GO，KEGG，eggNOG以及Swissprot五種蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)27431個(gè)Unigene 100%比對(duì)到NR數(shù)據(jù)庫中家山黧豆的蛋白序列信息，約72.4%比對(duì)到Swissprot數(shù)據(jù)庫（圖1）。
圖2 家山黧豆unigene的GO功能注釋分布
圖3 家山黧豆unigene的eggNOG功能注釋分布
圖4 家山黧豆unigene的KEGG功能注釋分布
通過對(duì)unigene進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)在GO（圖2）中大多數(shù)基因主要功能為生物過程中的代謝過程，細(xì)胞成分中的細(xì)胞和分子功能中的結(jié)合。在eggNOG（圖3）功能注釋中大多數(shù)基因主要聚類于的細(xì)胞功能未知功能和通用功能預(yù)測(cè)；在KEGG（圖4）中大多數(shù)基因注釋為糖代謝，轉(zhuǎn)錄，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡，內(nèi)分泌系統(tǒng)以及傳染性疾病。
將注釋到的家山黧豆的c39901_g1_il基因與近親——豌豆的SGR基因進(jìn)行比對(duì)（圖5），發(fā)現(xiàn)二者具有高度的一致性，并且功能類似，所以家山黧豆中的c39901_g1_il基因是豌豆SGR基因的同系物。這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)于家山黧豆的基因的進(jìn)一步挖掘和分子育種有著極大的幫助。
圖5 家山黧豆c39901_g1_il基因與豌豆的SGR基因蛋白序列比對(duì)結(jié)果
2.2 對(duì)43種家山黧豆進(jìn)行SSR和KASP標(biāo)記物的檢測(cè)
SSR是種植資源評(píng)價(jià)和有效繁殖的強(qiáng)有力的標(biāo)志之一，國內(nèi)外眾多研究小組在很多領(lǐng)域中使用這種分子工具，如基因多樣性，DNA指紋、遺傳連鎖圖譜、QTL映射和等位基因等研究領(lǐng)域。本篇文章作者通過使用微衛(wèi)星識(shí)別工具對(duì)兩種家山黧豆的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SSR高通量篩選，篩選出含有SSR的序列后，根據(jù)其側(cè)翼設(shè)計(jì)引物。對(duì)43種家山黧豆幼苗期的葉子進(jìn)行基因組DNA提取，進(jìn)行PCR，產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后硝酸銀染色。最終確定了87個(gè)多態(tài)性引物和88個(gè)單態(tài)性引物。
對(duì)于SNP的檢測(cè)，目前存在很多種方法，例如等位基因特異性PCR，熒光定量檢測(cè)，分子信標(biāo)與基因芯片SNP基因分型等，但這些方法均價(jià)格昂貴，而KASP作為一種新型的強(qiáng)有力的的SNP檢測(cè)方法，有著其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，結(jié)果精準(zhǔn)，效率高，價(jià)格親民，使得這一方法發(fā)展迅速。本篇文章對(duì)篩選出的146406 個(gè)SNP 隨機(jī)挑選50個(gè)SNP 基因座，使用KASP技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中42個(gè)SNP基因座可作為KASP標(biāo)志物，其中2個(gè)是單態(tài)性的，40個(gè)是多態(tài)性的。根據(jù)這一結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，較高比例的SNP可以作為KASP標(biāo)志物，那么未來可以將特定特征的SNP作為KASP標(biāo)志物確定的參考目標(biāo)。
使用兩種計(jì)算方法對(duì)43個(gè)家山黧豆的87個(gè)SSR和42個(gè)KASP標(biāo)志物制作系統(tǒng)樹狀圖（圖6）。雖然這兩種計(jì)算方法得到的系統(tǒng)樹狀圖存在細(xì)小差別，但所有組別之間的關(guān)系是相似的。SSR和KASP標(biāo)志物的結(jié)果對(duì)于評(píng)估家山黧豆基因的遺傳多樣性有著非常重要的作用，同時(shí)也為家山黧豆的基因改良育種提供理論參考。
圖6 家山黧豆SSR和KASP標(biāo)志物系統(tǒng)樹狀圖
本研究的測(cè)序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
參考文獻(xiàn)：
X Hao, T Yang, R Liu, J Hu, Y Yao, & M Burlyaeva, et al. (2017). An rna sequencing transcriptome analysis of grasspea (lathyrus sativus l.) and development of ssr and kasp markers. Frontiers in Plant Science, 8, 1873.
