2017-09-15
最近，派森諾生物與中國科學院南京土壤研究所合作，再次在土壤學期刊《Soil Biology & Biochemistry》（影響因子4.857）發表論文，以25年長期定位施肥的湖南祁陽紅壤作為研究對象，探究不同施肥處理下土壤的理化性質及固氮菌菌群豐度、群落結構的差異。
研究背景
紅壤是一種酸性土壤，在中國長江以南分布較廣，因其貧瘠的肥力，嚴重制約了農業發展，而施肥作為一種能夠快速、提高土壤肥力的手段得到廣泛應用。幾十年來，隨著氮磷鉀無機肥的大量使用（尤其是氮肥），土壤的肥力和作物產量得到大幅提升的同時，也帶來了土壤酸化、金屬毒性、溫室效應、地下水污染等環境問題，嚴重影響了土壤質量、農作物成長及土壤微生物的多樣性。減少無機肥的使用、保持農業的可持續性發展，勢在必行。
生物固氮，是指固氮微生物以自生固氮、共生固氮和聯合固氮的形式將大氣中的氮氣化為氨的過程。生物固氮在提高農作物產量、降低化肥使用量、減少水土污染、保持農業可持續發展、降低能源消耗等方面具有重要作用。可緩解和減輕農業生產中長期和大量依賴工業氮肥所造成的能源和環境問題。
因此，探究長期施用無機肥對土壤中固氮菌豐度和群落結構的影響，具有重要意義。
研究目的
1、探究長期無機肥處理對土壤理化性質、固氮菌豐度和群落結構的影響，及其內在聯系；
2、評估長期無機肥處理對土壤中作物根際效應的影響；
3、檢驗生石灰的施用是否能夠增加酸性土壤中固氮菌的含量。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組功能基因nifH區測序
實驗對象：經過25年定位施肥的湖南祁陽紅壤試驗田（該試驗田自1990年開始進行夏玉米-冬小麥輪作）
實驗設計：2015年6月12日（玉米開花時節）開始采樣，以下處理各3個生物學重復。
組名 | 處理方法 | 采樣方式 |
CK | 不施肥 | 分別采集植物根際土和非根際土樣本，各處理各采樣點各3個生物學重復 |
N | 施用氮肥 | |
PK | 施用磷鉀肥 | |
NPK | 施用氮磷鉀肥 | |
NCa | 2010年開始在只施用氮肥的田中增施生石灰 | |
NPKCa | 2010年開始在施用氮磷鉀肥的田中增施生石灰 |
研究結果
實驗發現，長期施用氮肥（N）會顯著減少玉米產量，而磷鉀肥（PK）的施用則能夠使玉米產量增加，且在加入生石灰后，玉米產量再次大幅提升。
土壤生理生化特性測定結果表明，在根際土中，有機碳（SOC）、溶解性碳（DOC）、溶解性氮（DON）的含量比非根際土高，而銨態氮（NH4+ -N）、硝態氮（NO3- -N）、有效磷（AP）和有效鉀（AK）則較低。N、PK、NPK的PH值顯著低于CK、NCa、NPKCa，N組和NPK組PH值低。PK、NPK、NPKCa的總碳（TC）、有機碳（SOC）、溶解性碳（DOC）含量高于CK、N、NCa。在施用了氮肥的N、NCa、NPK、NPKCa中，銨態氮（NH4+ -N）、硝態氮（NO3- -N）、總氮（TN）的含量比CK、PK高，除了NPKCa中的NH4+ -N和NO3- -N。在施用了磷鉀肥的處理組中，AK和AP的含量較高。除了NCa，在其他施用氮肥的處理組中，C/N的比例較低。DON含量在CK、N、PK、NPK中未表現出顯著差異。
2.nifH的基因拷貝數及其與土壤性質的聯系
熒光定量PCR結果表明，施肥處理和根際效應均對nifH基因拷貝數產生了顯著影響。其中，各處理根際土的nifH基因拷貝數顯著高于非根際土。對于不同施肥處理組，PK、NPKCa的nifH基因拷貝數顯著高于對照組，而施用了N肥的N、NPK則低于對照組。生石灰的加入減輕了由于N肥施用引起的對nifH基因的抑制作用。
皮爾森關聯分析結果顯示，在非根際土中，nifH基因拷貝數與PH、C/N、AP呈正相關，與NH4+ -N、NO3- -N呈負相關；在根際土中，nifH基因拷貝數與PH、C/N、AP呈正相關，與NH4+ -N、NO3- -N呈負相關；在所有樣品中，nifH基因拷貝數與PH、C/N、SOC、DOC、DON呈正相關，與NH4+ -N、NO3- -N呈負相關。
3.固氮菌群落結構分析
對不同施肥處理樣本的nifH基因進行高通量測序，得到107039條序列，基于序列進行數據分析。NMDS分析和樹狀圖聚類分析結果顯示，CK和PK的根際土和非根際土樣本間距離較近，群落結構較為相似；N和NCa的根際土和非根際土較為相似；NPK和NPKCa較為相似。ANOSIM分析結果顯示，無氮肥添加的CK、PK與氮肥添加組N、NCa、NPK、NPKCa的菌群組成具有顯著差異，但根際土和非根際土的樣本間無顯著差異。因此，可得出結論：施肥處理對土壤中微生物菌群組成及群落結構的影響要遠大于根際效應及是否添加生石灰。
4． 不同施肥處理下固氮菌的相對豐度差異
OTU劃分結果顯示，所有處理組的OTU豐度均顯著低于對照組。N、PK、NPK、NPKCa的OTU豐度無顯著差異，意味著生石灰的加入并未顯著改善氮肥的施加造成的OTU豐度降低。
物種分類組成分析結果顯示，在屬水平，Bradyrhizobium的相對豐度具優勢。較之于CK，N和NPK中Methylosinus的相對豐度顯著增加，而Bradyrhizobium、 Rhodopseudomonas、Xanthobacter和Caenispirillum顯著降低。生石灰的加入，使NCa、NPKCa中Bradyrhizobium的相對豐度較N、NPK有所增加。在PK組中，Bradyrhizobium 和Azovibrio的豐度有所降低，但Rhodopseudomonas、Caenispirillum和Phaeospirillum有所增加。
5.固氮菌群落結構與土壤性質之間的關系
RDA分析結果顯示，CK、PK的固氮菌相對豐度與土壤PH呈正相關，PK與C/N、AK呈正相關；NPK與TC、SOC、DOC呈正相關；N、NCa與NH4+ -N、NO3- -N呈正相關。
總結
本文通過對中國南部酸性土壤進行長達25年的不同施肥處理，發現無機肥中N元素對土壤中固氮菌菌群的影響大于P和K；氮肥的長期施用會降低土壤中固氮菌相對豐度，削弱土壤生物固氮強度；而生石灰的施用則能夠通過增加土壤中固氮菌含量提高生物固氮；適度、營養均衡的施肥方式及控制土壤酸度對生物固氮具有重要影響；對于土壤中固氮菌群落組成的影響，施肥處理遠大于根際效應。
本研究的測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：Wang C, Zheng M, Song W, et al. Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in southern China[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 113: 240-249.
點擊鏈接，閱讀原文：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071717304017
