2024-11-15
期刊：ADVANCED SCIENCE
通訊作者：張莎莎、柴人杰
單位：東南大學
影響因子：IF14.3
研究方向：內耳毛細胞再生與保護；耳聾基因致聾機制
一、研究背景
小細胞外囊泡（sEVs）是細胞間通訊的重要介質。與體外來源的sEVs相比，組織來源的sEVs可以更準確地反映特定組織釋放的體內信號。目前，有關sEVs在耳蝸中的作用的研究主要依賴于體外來源的sEVs。因此，東南大學張莎莎、柴人杰作為共同通訊作者，2024年11月5日在Advanced Science 發表了題為“Isolation and Comprehensive Analysis of Cochlear Tissue-Derived Small Extracellular Vesicles”的研究論文。研究應用小RNA測序、蛋白質組學分析耳蝸組織來源sEV（CDsEV）的miRNA和蛋白質，并且應用單個CDsEV測序和單細胞RNA測序數據的聯合分析來追蹤CDsEVs的細胞來源。其中單CDsEV-RNA測序和部分數據分析由上海派森諾完成。
Highlight：
①該研究評估了三種耳蝸組織消化方法和CDsEV分離方法，首次提出了使用膠原酶D和DNase ?結合蔗糖密度梯度離心分離CDsEVs的最佳方法。
②該研究全面研究了CDsEVs的內容。發現CDsEVs的miRNA和蛋白質對于維持正常的聽覺功能至關重要，CDsEVs中的FGFR1可能通過sEVs介導耳蝸毛細胞的存活。
③該研究全面研究了CDsEVs細胞來源。通過單外泌體RNA測序發現不同類型的耳蝸細胞分泌的CDsEVs數量不同，其中K?lliker器細胞和支持細胞分泌最多。
小細胞外囊泡（sEVs）的直徑在30–200 nm，可被幾乎所有類型的細胞分泌到體液（例如血液、尿液、唾液、淚液和腦脊液）和間質中，對sEVs及其內容物的研究對于闡明細胞間通訊機制和增強臨床診斷和治療具有重要意義。過去幾年，組織來源的 sEV（TDsEV）已成為生物醫學研究的重點。然而，因為在TDsEV分離過程中會被破裂細胞的細胞囊泡污染，TDsEVs的分離和檢測仍然具有挑戰性。
傳統分離技術超速離心、超濾法、共聚沉淀、免疫磁珠等都會引入更復雜的成分，而傳統的檢測方法例如TEM，NTA，WB又缺乏外泌體的細胞來源信息（2021，姚波）。本研究提供了針對CDsEVs的分離方法，結合多組學，包括單個細胞層面的高通量檢測的思路，為增強對耳蝸中CDsEVs的認識提供了很好的參考。
二、研究思路
三、研究結果
1.三種耳蝸組織消化方法和CDsEV分離方法評估
考慮到即使是最溫和的研磨也不能完全避免細胞內容物的污染，導致提取的CDsEV存在雜質，阻礙了進一步的功能研究，需要建立最優的酶切方法，最大限度地避免細胞損傷，并將CDsEV釋放到組織細胞間隙。本研究評估了膠原酶D聯合DNase Ι、單獨使用膠原酶III和單獨使用木瓜蛋白酶的消化效果，以確定消化新生小鼠耳蝸組織的最佳酶。隨后采用UC、蔗糖密度梯度超離心（SDGU）和SEC分離CDsEV，并通過對比分析最終選定以3u膠原酶D和40u dna酶Ι消化耳蝸后，SDGU分離CDsEV（圖1-圖3）。
圖1：CDsEV分離、檢測流程圖
2.小RNA測序分析耳蝸組織來源sEV（CDsEV）的miRNA和蛋白質
通過小RNA測序分析了耳蝸樣本和CDsEV兩個樣本。共檢測到550個miRNA，其中兩組均有399個（圖4A、B），僅在CDsEV或耳蝸組織中存在的miRNA分別有73個和78個（圖4C）。GO通路富集分析發現sEV主要來源于核內體、早期核內體和晚期核內體，參與神經系統發育、囊泡介導的運輸、早期核內體到晚期核內體的運輸，參與多種重要細胞功能與信號通路（圖4G-H）。此外，KEGG分析發現65個CDsEV衍生的miRNA的靶基因參與多種聽覺活動信號通路（圖4I）。這些結果表明，CDsEV中的miRNA可能在聽覺個體發生和成熟過程中起調節作用。
圖4.CDsEV的小RNA測序分析
3.蛋白質組學探索CDsEV的蛋白質組成和生物學功能
以等量的耳蝸組織蛋白為對照，對CDsEV進行了無標記的定量蛋白質組學分析。每組包括3個生物重復，樣品間相關性良好（圖5A）。兩組共鑒定出4739個蛋白，其中CDsEV鑒定出3040個蛋白，耳蝸組織鑒定出4301個蛋白（圖5B）。通路富集分析（圖5F-H）表明CDsEV中的蛋白在聽力發育過程中積極參與耳蝸形成、HC成熟和突觸連接形成的生物學過程，對聽覺系統的建立和聲音感知具有重要意義。
圖5.CDsEV的小RN蛋白質組學分析
4.CDsEV FGFR1的表達和作用
通過WB、OC和SGN (圖6A-C)的免疫熒光染色檢測P3小鼠耳蝸BM、M和SL中FGFR1的表達。發現FGFR1表達受損會影響HC的存活和細胞凋亡。
圖6.CDsEV中FGFR1的表達和作用
5.單sEV-seq數據與耳蝸scRNA-seq數據的聯合分析追蹤CDsEV的細胞起源
利用10x Genomics測序平臺對CDsEV進行了單EV測序分析。通過CB2算法處理后，可以明顯區分比細胞小的CDsEV（圖7A）。之后，共檢測到536個符合條件的sEV（圖7B）。降維聚類為8個細胞群（圖7C）。
為了追蹤CDsEV的細胞起源，進一步將單個CDsEV-seq數據與耳蝸的scRNA-seq數據（GSE135913）整合，分為8個細胞群，每個細胞群都包含sev和耳蝸細胞，這表明CDsEV起源于許多不同的細胞類型（圖7E，F）。在8個細胞群中，SC簇中sEV的比例最高（38%，圖7G），這表明SC中每個細胞分泌的sEV數量最高。就每個細胞群中sEV的總數而言，SCs和K?lliker’s organ （KO）細胞中sEV的含量最高，這表明SCs和KOs比其他細胞群分泌更多的sEV（SCs和KOs中分別有161和158個sEV，圖7H）。這些結果表明，SCs和KOs具有最強大的CDsEV分泌能力，是CDsEV的主要來源。
圖7.單個CDsEV轉錄組與耳蝸scRNA-seq聯合分析
原文鏈接：Isolation and Comprehensive Analysis of Cochlear Tissue‐Derived Small Extracellular Vesicles - Jiang - Advanced Science - Wiley Online Library
