2024-07-19
近日，武漢大學(xué)中南醫(yī)院在生物學(xué)領(lǐng)域的《communications biology》發(fā)表新研究成果！本研究在4個(gè)ST1049-KL5肺炎克雷伯菌分離株中鑒定了一個(gè)結(jié)合的IncM1質(zhì)粒pKPC_NDM，它共同攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因。該質(zhì)粒表現(xiàn)出較高的種內(nèi)和種間可轉(zhuǎn)移性，并增強(qiáng)了碳青霉烯類耐藥性。本研究總結(jié)了KPC_NDM_CRKP爆發(fā)的特點(diǎn)，并強(qiáng)調(diào)了持續(xù)監(jiān)測和感染控制策略的重要性，以應(yīng)對ST1049肺炎克雷伯菌菌株帶來的挑戰(zhàn)。 本研究的細(xì)菌基因組完成圖測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 01、研究背景 肺炎克雷伯菌是一種重要的機(jī)會性病原體，可引起社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染。該菌引起的感染，特別是與碳青霉烯類耐藥性和高毒力相關(guān)的感染，可導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。碳青霉烯耐藥的多種機(jī)制涉及碳青霉烯酶的產(chǎn)生，其中碳青霉烯酶(KPC)和β-內(nèi)酰胺酶(NDM)是最常見的兩種類型。以前的研究主要集中在闡明KPC和NDM共同產(chǎn)生碳青霉烯抗性的出現(xiàn)，缺乏對其暴發(fā)的流行病學(xué)特征的全面探索。此外，blaKPC-2和blaNDM-1基因的存在通常與分離的質(zhì)粒有關(guān)，但這兩個(gè)碳青霉烯酶基因在同一質(zhì)粒內(nèi)共存以及它們潛在的協(xié)同作用的研究較少。 02、研究材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)材料：產(chǎn)KPC和NDM碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌 2.測序平臺：illumina+Pacbio 3.分析內(nèi)容：細(xì)菌基因組完成圖測序、比較基因組圈圖、easyfig遺傳環(huán)境分析、cgMLST分析、質(zhì)粒復(fù)制子分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建等 03、研究結(jié)果 肺炎克雷伯菌感染患者的臨床特點(diǎn) 本研究中所有患者均表現(xiàn)出嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，并伴肺炎克雷伯菌感染?？咕委煱é?內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合、碳青霉烯類以及多粘菌素B和替加環(huán)素。感染ST1049 KPC_NDM_CRKP的患者表現(xiàn)出較差的治療效果，4名患者中有2名死于多器官感染和敗血癥。相反，ST11 KPC_NDM_CRKP感染的患者表現(xiàn)出更有利的恢復(fù)。 肺炎克雷伯菌分離株的克隆性和遺傳親緣性 脈沖凝膠電泳顯示，除KP4007外所有ST1049肺炎克雷默菌分離株克隆親緣性高。分離株KP1527、KP2094和KP1078表現(xiàn)出相同的電泳譜帶，與初始分離株KP3594僅相差兩條譜帶。cgSNP進(jìn)化樹進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，揭示了ST1049 KPC_NDM_CRKP菌株之間密切的遺傳關(guān)系。相比之下，雖然ST11 KPC_NDM_CRKP組在系統(tǒng)發(fā)育譜上具有遺傳同源性，但其在PFGE模式上表現(xiàn)出克隆異質(zhì)性。 圖1 臨床肺炎克雷伯菌克隆及遺傳親緣關(guān)系分析 ST1049 KPC_NDM_CRKP質(zhì)粒的比較基因組分析 WGS測序揭示了KPC_NDM_CRKP菌株中對抗生素耐藥性和毒力基因譜上具有高遺傳多樣性。具體來說，blaKPC-2被發(fā)現(xiàn)存在于一個(gè)IncFII/IncR型多次耐藥質(zhì)粒上，而blaNDM-1在ST11 KPC_NDM_CRKP分離株的IncN/IncC質(zhì)粒中被鑒定出來。所有ST1049 KPC_NDM_CRKP分離株都含有76,517 bp的IncM1質(zhì)粒，該質(zhì)粒同時(shí)攜帶blaKPC-2、blaNDM-1和qnrS1基因；還攜帶一個(gè)含有多種抗生素耐藥基因及廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的IncFII(K)型耐藥質(zhì)粒，以及一個(gè)編碼毒力因子的IncFIB型質(zhì)粒。質(zhì)粒pKPC_NDM與本院之前存檔的質(zhì)粒CRKP_35_unnamed4完全一致，還與從浙江省的大腸桿菌EC14株中獲得的攜帶blaNDM-1的IncM2型質(zhì)粒pEC14-NDM-1高度相似。其他IncM1型質(zhì)粒則攜帶了blaKPC-2或blaCTX-M-3基因。pKPC_NDM中攜帶blaKPC-2的區(qū)域類似于在pKpc-LKEC中報(bào)道的NTEKPC-Id結(jié)構(gòu)，而blaNDM-1區(qū)域與IncN型質(zhì)粒pNDM1-CBG中的有較高相似性。 圖2 質(zhì)粒比較分析 轉(zhuǎn)導(dǎo)子/轉(zhuǎn)化子的表征描述和pKPC_NDM可轉(zhuǎn)移性的驗(yàn)證 從供體ST1049型KPC_NDM_CRKP菌株向受體大腸桿菌EC600成功轉(zhuǎn)移pKPC_NDM，其轉(zhuǎn)移頻率相較于ST11型KPC_NDM_CRKP中攜帶blaKPC-2或blaNDM-1的質(zhì)粒更高。pKPC_NDM還能從ST1049型KPC_NDM_CRKP進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌，并且能從供體大腸桿菌EC600::pKPC_NDM轉(zhuǎn)移至ST1049型CSKP受體中。本研究驗(yàn)證了野生菌株及攜帶pKPC_NDM的轉(zhuǎn)導(dǎo)子/轉(zhuǎn)化子中共表達(dá)KPC和NDM碳青霉烯酶。值得注意的是，在阿曲庫銨與頭孢他啶/阿維巴坦雙碟測試中觀察到的“鬼影區(qū)”現(xiàn)象，表明了對攜帶pKPC_NDM菌株的協(xié)同抑制作用。對pKPC_NDM進(jìn)行oriT分析，發(fā)現(xiàn)其與寬宿主范圍的接合性IncM2型質(zhì)粒pCTXM-360中的oriT_pCTXM360的相似度最高。與含有oriTKN位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)oriTKN與IncM1型接合質(zhì)粒之間存在強(qiáng)烈的相關(guān)性，強(qiáng)調(diào)了其在IncM1質(zhì)粒傳播中的關(guān)鍵作用。此外，oriTKN序列的插入促進(jìn)了E. coli S17中pUCP24自發(fā)向E. coli EC600和肺炎克雷伯菌ATCC 700603的接合轉(zhuǎn)移。 圖3 使用APB/EDTA增強(qiáng)方法進(jìn)行碳青霉烯酶表型確認(rèn) pKPC_NDM受者的穩(wěn)定性、不相容性和碳青霉烯耐藥維持 當(dāng)通過接合引入ST1049型CSKP受體和大腸桿菌EC600時(shí)，pKPC_NDM表現(xiàn)出強(qiáng)大的穩(wěn)定性。然而，碳青霉烯耐藥性維持結(jié)果顯示，在傳代過程中，3.9%的大腸桿菌受體和2.3%的肺炎克雷伯菌受體喪失了碳青霉烯耐藥性，所有這些菌株均丟失了整個(gè)pKPC_NDM質(zhì)粒。有趣的是，一個(gè)特定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子降低了碳青霉烯耐藥性但失去了對CAZ/AVI的耐藥性，測序結(jié)果確定了blaNDM-1基因區(qū)域的丟失。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，利用CRISPR-Cas9方法成功敲除了blaKPC-2基因，但嘗試敲除blaNDM-1基因?qū)е滤拗骶陙G失了整個(gè)pKPC_NDM質(zhì)粒。不相容性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pKPC_NDM與KPC或NDM產(chǎn)生的CRKP菌株中原有的IncFII/IncR型blaKPC-2質(zhì)粒和IncN或IncC型blaNDM-1質(zhì)粒相容，所有轉(zhuǎn)化菌落即便在無抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)后仍保留了pKPC_NDM以及攜帶blaKPC-2或blaNDM-1的質(zhì)粒。 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 KPC_NDM_CRKP菌株對所有臨床使用的β-內(nèi)酰胺類藥物均表現(xiàn)出耐藥性，然而他們?nèi)匀粚Χ嗾尘谺和替加環(huán)素等最后手段的抗生素敏感，并對氨基糖苷類、喹諾酮類和甲氧芐胺甲惡唑表現(xiàn)出不同的耐藥模式。盡管CAZ/AVI的效力有限，但AVI與ATM或美西林南聯(lián)合治療對KPC_NDM_CRKP菌株有顯著改善。此外，當(dāng)blaKPC或blaNDM攜帶區(qū)域被刪除時(shí)，觀察到碳青霉烯類MIC降低了兩倍。 致病性評估及時(shí)效測定結(jié)果 大多數(shù)KPC_NDM_CRKP分離株對人血清表現(xiàn)出高敏感性，ST1049型肺炎克雷伯菌的整體生物膜產(chǎn)生量顯著高于ST11型肺炎克雷伯菌。時(shí)間殺滅實(shí)驗(yàn)顯示，就體外針對KPC_NDM_CRKP菌株而言，頭孢他啶/阿維巴坦、阿曲庫銨或美羅培南單藥治療效果有限，而聯(lián)合療法則展現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。 圖4 臨床肺炎克雷伯菌致病性特征及時(shí)間殺傷曲線 ST1049肺炎克雷伯菌和KPC_NDM_CRKP核心基因組多位點(diǎn)序列分型分析 使用138個(gè)肺炎克雷伯菌基因組進(jìn)行cgMLST分析，包括23個(gè)ST1049菌株和115個(gè)其他序列類型的KPC_NDM_CRKP菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ST1049主要在中國區(qū)域流行，且在KPC_NDM_CRKP菌株間存在顯著多樣性。KPC_NDM_CRKP的流行涉及幾個(gè)成功的克隆，這表明了基因組和地理上的異質(zhì)性。有趣的是，ST1049 KPC_NDM_CRKP的爆發(fā)最初僅在本院觀察到，這提示了一種可能的醫(yī)院內(nèi)傳播鏈。此發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了對這一特殊克隆進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控和感染控制的重要性，以防止其進(jìn)一步擴(kuò)散。 圖5 核心基因組多位點(diǎn)序列分型(cgMLST)分析 04、 結(jié) 論 攜帶同時(shí)擁有blaKPC-2和blaNDM-1基因的IncM1型質(zhì)粒pKPC_NDM的ST1049-KL5型CRKP的出現(xiàn)及克隆傳播對公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本研究凸顯了ST1049型菌株作為高毒性及多重耐藥質(zhì)粒攜帶者的潛力，強(qiáng)調(diào)了持續(xù)監(jiān)測和實(shí)施有效感染控制策略的重要性。這些發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)對復(fù)雜耐藥機(jī)制和病原體傳播動態(tài)的理解，而且為未來針對性的治療干預(yù)和防控措施提供了科學(xué)依據(jù)。 如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：021-80118168-8617）！
文章索引： Liu, Hongmao, et al. "Prevalence of ST1049-KL5 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with a bla KPC-2 and bla NDM-1 co-carrying hypertransmissible IncM1 plasmid." Communications Biology 7.1 (2024): 695.
