2024-07-21
文章題目：Late gestational exposure to fenvalerate impacts ovarian reserve in neonatal mice via YTHDF2-mediated P-body assembly 重慶醫科大學在《Science of the Total Environment》上發表了妊娠后期暴露于氰戊菊酯通過YTHDF2介導的p小體組裝影響新生小鼠卵巢儲備的研究成果。本研究中轉錄組檢測及部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景 氰戊菊酯（FEN）是一種具有雌激素樣活性的環境內分泌干擾物（EDC），對卵巢功能有不良影響。此外，女性尿液中FEN代謝物的存在與原發性卵巢功能不全（POI）的風險呈正相關。在哺乳動物中，生命早期建立的原始卵泡池作為儲存庫，在整個雌性生殖生命中儲存所有可用的卵母細胞。原始卵泡池的初始大小及其耗盡率影響POI的發生。然而，關于FEN暴露對原始卵泡發生影響的研究非常有限。
02、研究方法 材料：CD1小鼠 處理：將妊娠小鼠（F0）隨機分為4組，分別為FEN給藥0.2、2.0、20.0 mg/kg-bw/d組及對照組，分娩后第1天和第5天分離新生兒小鼠（F1）卵巢，同時，在相同條件下培養F1雌性小鼠至8周齡，分離卵巢和血清。 技術：RNA-seq、IP-MS、Western-Blot等
03、技術路線
03、研究結果 1、妊娠晚期暴露于FEN會損害新生小鼠的原始卵泡形成 在交配后16.5 - 18.5天（dpc）連續3天灌喂0.2、2.0和20.0 mg/kg的FEN，并在分娩后1天（1dd）采集新生兒卵巢。與對照組相比，2.0和20.0 mg/kg FEN組中出現大量的生殖細胞囊腫，FEN組卵巢總卵母細胞數量顯著增加。5dd后，囊腫卵母細胞幾乎消失，與對照組相比，2.0和20.0 mg/kg FEN組的原始卵泡數量與總卵母細胞數量顯著減少。通過Western-Blot檢測凋亡調節因子BAX和BCL2的表達。結果顯示，與對照組相比，兩個FEN組1dpp小鼠卵巢中BAX/BCL2的比值顯著降低，表明1dpp小鼠的細胞凋亡受到抑制。在5dpp卵巢中，BAX/BCL2的比例在所有組中表現出一致的模式，表明持續的細胞凋亡（圖1）。這些結果表明，妊娠后期暴露于FEN會破壞原始卵泡形成并損害卵巢初始儲備。 圖1 FEN可破壞新生兒卵巢的原始卵泡形成 2、FEN增加新生兒卵巢中m6A水平和YTHDF2表達水平 Dot-Blot和IHC結果顯示，2.0和20.0 mg/kg FEN組1dpp卵巢中RNA的總體m6A水平顯著高于對照組。Western-Blot分析檢測了m6A甲基化轉移酶METTL3、m6A去甲基化酶ALKBH5和m6A甲基化閱讀蛋白（YTHDF2等）的表達。與對照組相比，兩組1dpp卵巢中METTL3、YTHDF2水平顯著升高，而各組間ALKBH5的表達沒有顯著變化。此外，兩種劑量的FEN暴露均導致囊腫卵母細胞細胞質中YTHDF2的顯著積累。Western-Blot和IF進一步證實，在16.5 dpc至5 dpp期間，YTHDF2主要存在于卵巢囊腫的卵母細胞以及卵泡中，提示其在早期卵子發生中起調節作用（圖2）。上述結果表明，妊娠后期暴露于FEN可導致新生兒卵巢中m6A水平升高，YTHDF2表達升高。 圖2 暴露于FEN對1dpp卵巢m6A水平和m6A相關蛋白的影響 3、YTHDF2招募相關蛋白調控新生兒卵巢基因表達 采用IP-MS分析研究暴露于20.0 mg/kg FEN的1dpp卵巢中與YTHDF2相關的蛋白質。在對照組和20.0 mg/kg FEN組中，共鑒定出1223個和985個推測的YTHDF2互作蛋白，兩組中共有840個相互作用蛋白，主要富集在mRNA加工、細胞質顆粒和mRNA結合相關的途徑中。其中，檢測到多個m6A甲基化閱讀蛋白，如“IGF2BP1-3, HNRNPA2B1”，包括核心蛋白“DDX6”和最近發現的蛋白“HNRNPU, DHX9, MYO6, MYO1C”在內的多個參與P小體（P-body）組裝的蛋白，以及“G3BP1”等應激顆粒（SGs）組裝蛋白。 此外，RNA-seq顯示，暴露于20.0 mg/kg FEN的1dpp卵巢中有128個DEGs，其中91個上調，37個下調。GO分析顯示，DEGs在免疫反應、刺激反應和應激反應中富集。DEGs是否可能是YTHDF2的直接靶點？GACU/A是YTHDF2的主要結合基序。因此，對GACU/A序列在DEGs起始和終止密碼子周圍±400 bp范圍內的富集程度進行分析。分析顯示，在暴露于FEN的卵巢中，上調和下調基因之間的GACU/A基序富集改變，表明YTHDF2可能調節DEGs（圖3）。 圖3 FEN暴露對YTHDF2相互作用蛋白及基因表達的影響 4、FEN暴露促進新生兒卵巢中YTHDF2介導的P小體組裝 通過公認的p小體標記物DDX6檢測發育的卵巢中p小體的組裝。與YTHDF2類似，DDX6在16.5 dpc至5 dpp的原始卵泡發育期間的卵巢中表達，在囊腫和原始卵泡的卵母細胞內可見明顯明亮的胞質集合體。與對照組相比，2.0和20.0 mg/kg FEN組在1 dpp卵巢中DDX6的表達進一步顯著增加，表明促進了p小體的形成。此外，mIF和Co-IP證實了FEN暴露誘導的YTHDF2與DDX6的相關性增加。透射電鏡顯示，20.0 mg/kg的FEN組有大量活躍的高爾基體，特點是體積增大，池堆積，并有多種分泌顆粒存在。這些發現表明FEN暴露促進YTHDF2介導的 P小體組裝，隨后影響新生兒卵母細胞中的RNA代謝和翻譯（圖4）。 圖4 FEN暴露促進YTHDF2和DDX6相互作用調節新生兒卵巢P小體組裝 5、YTHDF2介導FEN暴露的卵巢中異常原始卵泡發生 為了進一步探討FEN對卵巢發育的影響，收集16.5 dpc卵巢，分別用0、2、20μM FEN培養4天（相當于1 dpp）。在卵巢培養中，FEN組的原始卵泡百分比明顯下降，囊腫卵母細胞的發生率明顯增加，表明FEN直接抑制了原始卵泡的形成。mIF實驗證實，與對照組（DMSO）相比，在2或20μM FEN的處理下，YTHDF2和DDX6的共定位增加。這些結果與妊娠暴露的新生小鼠中發現的FEN的影響一致。此外，將攜帶靶向YTHDF2 shRNA的慢病毒引入16.5 dpc子房培養中，YTHDF2表達降低導致YTHDF2與DDX6共定位的顯著減少，同時DDX6的病灶減少。這些結果表明，YTHDF2促進了胎兒卵巢中暴露于FEN的p小體組裝。隨后，對原始卵泡形成的分析表明，敲低YTHDF2可有效逆轉FEN對原始卵泡形成的抑制作用。與20μM FEN+sh-NC組相比，20μM FEN+sh-YTHDF2組原始卵泡內卵母細胞比例顯著升高，囊腫卵母細胞比例顯著降低。上述結果表明，FEN通過YTHDF2介導的p小體組裝破壞原始卵泡發生（圖5）。 圖5 敲低YTHDF2可逆轉FEN對卵巢培養中原始卵泡發生的影響 6、妊娠后期暴露于FEN會影響雌性后代的卵巢功能 為了研究妊娠后期暴露于FEN對成年后代卵巢功能的影響，雌性幼崽（F1代）在FEN組和對照組均被培養到8周齡。與對照組相比，妊娠后期暴露于FEN導致F1雌性小鼠體重顯著增加。在8周大時，這些小鼠與有生育能力的雄性小鼠配對。雖然各組間第一窩幼鼠數量無顯著差異，但F2小鼠的出生體重較對照組有顯著增加。8周齡F1小鼠卵巢形態學分析顯示，20.0 mg/kg FEN組卵巢最大截面積顯著小于對照組，卵巢系數（卵巢濕重與體重之比）也顯著降低。采用ELISA法測定8周齡F1雌性小鼠血清激素水平。結果顯示，與對照組相比，FEN暴露組的促性腺激素（FSH）和促黃體生成素（LH）水平顯著升高，同時孕酮（P4）和抗繆勒管激素（AMH）水平顯著降低。雌激素（E2）水平保持不變。這些觀察結果與POI的特征非常相似（圖6）。 研究結果表明，妊娠后期暴露于FEN會對成年后雌性后代的卵巢功能產生持久影響，這可能源于其早期生活中原始卵泡發生的受損。 圖6 妊娠晚期暴露于FEN對子代卵巢功能的影響
04、研究結論 該研究首次證明，妊娠后期暴露于FEN破壞了原始卵泡發育，并可能導致后代成年后發生POI的可能性。我們發現FEN誘導了m6A修飾的改變，并觸發了YTHDF2對p小體的組裝。該研究與健康與疾病的發育起源理論（DOHaD）一致，即在生命早期接觸EDCs會影響女性的發育，并有助于其長期的生殖健康結果。
原文鏈接 https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2024.171790
