2024-06-17
近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在《Horticulture Research》發(fā)表新研究成果！本研究將一個黃油生菜品種（同樣攜帶Lskipk突變）與一個結(jié)球生菜品種雜交，并進(jìn)行了BSR遺傳定位分析，鑒定出一個新的編碼ATP酶的基因，該基因同樣對黃油生菜的株型有所貢獻(xiàn)。進(jìn)一步通過敲除與互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LsATPase功能的缺失也是形成黃油生菜株型所必需的。本研究結(jié)果不僅增進(jìn)了對控制生菜等蔬菜作物特定性狀遺傳基礎(chǔ)的理解，也為實(shí)現(xiàn)作物品種的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)和高效培育奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)，有望在未來的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 本研究的BSR測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 研究背景 植物的株型特征是一個綜合性的表型，受到多種基因和環(huán)境因素的調(diào)控。對于觀賞植物和葉類蔬菜而言，植物株型也是一種感官性狀。因此，鑒定調(diào)控植物株型的關(guān)鍵基因并闡明其功能機(jī)制，對未來的作物理想株型育種具有重要意義。 生菜作為一種全球范圍內(nèi)重要的葉類蔬菜作物，展現(xiàn)出了豐富的植物株型變異。然而，形成這種緊湊型植物株型背后的遺傳與分子機(jī)制尚未完全明了。本研究旨在探討黃油生菜植物株型的遺傳基礎(chǔ)，通過構(gòu)建分離群體，遺傳克隆了控制黃油生菜植物株型的兩個基因，這兩個新基因通過調(diào)控細(xì)胞壁的發(fā)育來影響黃油生菜的植物株型。 研究材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)材料：黃油生菜品種（W6-29885）、莖用生菜品種（W1168）以及其雜交構(gòu)建的子代家系、莖用生菜（Y37）、散葉生菜（S1）以及其雜交構(gòu)建的子代家系、結(jié)球生菜等。 2.測序平臺：Illumina 3.分析內(nèi)容：BSR測序分析、CRISPR/Cas9敲除、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)、RNA-seq、電鏡、RT-PCR等。 研究結(jié)果 控制緊湊型株型的基因座與黃油生菜株型的位點(diǎn)重疊 本文通過莖用生菜品種與黃油生菜品種雜交構(gòu)建了一個分離群體，并利用F3代家系克隆了一個控制黃油生菜植物株型的基因。由于單一基因不足以解釋黃油生菜的植物株型，作者進(jìn)一步構(gòu)建了另一個分離群體，遺傳克隆了控制黃油生菜植物株型的第二個基因。與結(jié)球生菜葉簇形成的機(jī)制不同，這兩個新基因通過調(diào)控細(xì)胞壁的發(fā)育來影響黃油生菜的植物株型。 圖1 遺傳定位控制黃油生菜緊密株型的基因 LsKIPK功能的喪失有助于緊湊的植物株型和黃油生菜株型的形成 敲除LsKIPK得到2個突變體，均展現(xiàn)出緊湊型株型（圖2A），互補(bǔ)陽性株均變?yōu)樯⑷~型（圖2C）。將LsKIPK的互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黃油生菜品種PI370472中，其轉(zhuǎn)化株的株型轉(zhuǎn)變?yōu)樯⑷~型（圖2D）。因此，LsKIPK功能的缺失也促成了黃油生菜的株型和緊湊型株型。 proLsKIPK:：GUS轉(zhuǎn)基因株系的GUS染色顯示，LsKIPK在中脈和葉片中高表達(dá)，在頂端分生組織、莖、根和成熟花瓣中中等表達(dá)（圖2E）。RT-qPCR結(jié)果與GUS染色結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位顯示LsKIPK蛋白位于細(xì)胞膜上（圖2G）。 圖2 LsKIPK的功能驗(yàn)證 所有黃油生菜品種都有Lskipk和Lsatpase的突變 從660份生菜資源中篩選出34個結(jié)球生菜品種，其中11個的LsKIPK基因存在一個點(diǎn)突（A633V），命名為Lskipk1（圖3A）。PI577117（Lskipk1）互補(bǔ)陽性轉(zhuǎn)基因株（COM#35-2）的株形變?yōu)樯⑷~，表明Lskipk1同樣是非功能性的，并且對結(jié)球生菜的株形有貢獻(xiàn)（圖3B）。 調(diào)查生菜資源中LsATPase的基因型，發(fā)現(xiàn)所有34個結(jié)球生菜均攜帶有Lsatpase等位基因，與本文結(jié)論一致，即LsATPase功能喪失是結(jié)球生菜植株形態(tài)所需的；在38個莖用生菜中，有30個擁有Lsatpase1等位基因。除結(jié)球生菜和莖用生菜外，其他園藝類型的LsATPase均為野生型。相比之下，其他園藝類型中沒有一個是雙突變體，盡管62.5%到88.9%為單突變體（圖4C）。表明LsKIPK和LsATPase的功能缺失對于結(jié)球生菜的植株形態(tài)是必要的。 圖3 Lsatpase基因LsKIPK和LsATPase功能的喪失有助于黃油生成株型的形成 Lskipk-Lsatpase雙突變體具有較小的葉片和葉角 敲除株的葉片長、寬、大小及角度均小于受體植物（圖4A-C），說明雙突（Lskipk Lsatpase）而非單突變體具有減小的葉片尺寸。與野生型受體相比，敲除株的細(xì)胞長度顯著縮短（圖4D）。因此，Lskipk Lsatpase通過減少細(xì)胞長度來減小葉片尺寸。 葉片中脈的橫截面顯示，敲除株的中脈比受體的更寬且厚（圖4E）。此外，敲除株中脈所需的最小折斷力顯著高于野生型受體（圖4F），并且敲除株的葉片聯(lián)合長度明顯長于受體（圖4G和H）。因此，Lskipk Lsatpase通過增強(qiáng)葉片中脈和葉片聯(lián)合的機(jī)械強(qiáng)度來減小葉片角度。 圖4 Lskipk-Lsatpase雙突的形態(tài)學(xué)研究 LsKIPK和LsATPase在細(xì)胞壁和纖維素發(fā)育中的作用 已知背腹性基因主要富集在“細(xì)胞壁組織或生物合成”、“外部包裹結(jié)構(gòu)組織”和“多糖代謝過程”（圖5A和B）；RT-qPCR結(jié)果顯示，這些基因在LsKIPK-COM和LsATPase-COM植株中顯著高表達(dá)（圖5C）。綜合這些結(jié)果表明，LsKIPK和LsATPase可能通過影響參與細(xì)胞壁發(fā)育基因的表達(dá)來改變細(xì)胞形態(tài)。 TEM結(jié)果顯示：LsKIPK和LsATPase可能通過影響細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞壁發(fā)育，從而貢獻(xiàn)于結(jié)球生菜特有的植株結(jié)構(gòu)。 圖5 LsKIPK和LsATPase影響細(xì)胞壁的發(fā)育 結(jié) 論 1、Lskipk和Lsatpase的雙重突變對于結(jié)球生菜緊湊植株結(jié)構(gòu)的形成既是必要的也是充分的。 2、LsATPase與LsKIPK之間的關(guān)系對于全面揭示決定生菜特有形態(tài)特征的遺傳基礎(chǔ)至關(guān)重要。 3、Lskipk-Lsatpase通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁發(fā)育控制生菜的株型。 4、緊湊株型的生菜是生產(chǎn)的理想類型。 總結(jié)而言，本研究不僅增進(jìn)了對控制生菜等蔬菜作物特定性狀遺傳基礎(chǔ)的理解，也為實(shí)現(xiàn)作物品種的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)和高效培育奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)，有望在未來的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：021-80118168-6611）！ 文章索引：Xie, Sai, et al. Lskipk Lsatpase double mutants are necessary and sufficient for the compact plant architecture of butterhead lettuce.Horticulture Research, 2024, 11: uhad280.
