2024-06-03
天津科技大學張翠英教授團隊在國際食品Top期刊《Food Research International》發(fā)表新科研成果。通過研究傳統(tǒng)高溫大曲（HTD-T）和機械高溫大曲（HTD-M）在發(fā)酵參數(shù)、酶學特性、微生物組裝和演替模式、代謝表型等方面的差異，結(jié)合相關(guān)性分析和功能預測，發(fā)現(xiàn)機械大曲峰溫滯后影響了初期細菌群落組裝模式，且HTD-T和HTD-M代謝通路不同，確定了造成HTD-T和HTD-M大曲代謝表型差異的核心物種，以及HTD特征風味微生物代謝的關(guān)鍵正向驅(qū)動因素，揭示了HTD-T和HTD-M之間發(fā)酵異質(zhì)性機制，為優(yōu)化和改進現(xiàn)代機械化HTD生產(chǎn)提供了新的思路。
派森諾提供了微生物多樣性測序和部分分析服務~
PART 1、研究背景
大曲是白酒釀造的重要發(fā)酵劑，長期以來一直是白酒釀造的核心紐帶。高溫大曲（HTD）的糖化力和發(fā)酵能力明顯弱于其他大曲，因此要求其在醬香型白酒釀造過程中更高的投入比例（~100%），對醬香型白酒的香氣形成具有重要貢獻作用。隨著科技進步，機械工藝在大型HTD企業(yè)中得到了廣泛應用，但機械工藝生產(chǎn)的HTD與傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的HTD質(zhì)量存在差異。然而，現(xiàn)有研究對這一現(xiàn)象背后的機制理解暫不清晰。因此深入探究HTD-T和HTD-M發(fā)酵異質(zhì)性機制，確定影響HTD質(zhì)量的關(guān)鍵因素，并制定HTD-M高品質(zhì)生產(chǎn)新策略至關(guān)重要。
PART 2、實驗設計
1.目的：以發(fā)酵不同階段的機械大曲和傳統(tǒng)大曲作為研究對象，通過監(jiān)測大曲中細菌和真菌動態(tài)變化以及代謝產(chǎn)物，探究微生物與靶標代謝物、微生物與理化因子之間的相關(guān)性，從而確定導致機械大曲和傳統(tǒng)大曲質(zhì)量差異的生物和非生物因素及其作用途徑。
2.分組設計：傳統(tǒng)發(fā)酵室和機械發(fā)酵室中分別采集發(fā)酵0 d、8 d、16 d、40 d的樣品，即T00-T40和M00-M40，以及成熟樣品，即TM和MM，共10組高溫大曲樣本。
3.測序平臺：Illumina NovaSeq PE250
4.測序區(qū)域：細菌16S V3-V4區(qū)（338F/806R）、真菌ITS1（ITS1F/ITS2R）
5.其他分析：發(fā)酵參數(shù)及酶活檢測、揮發(fā)性代謝物檢測、有機酸和氨基酸檢測等。
PART 3、研究結(jié)果
1.機械成品大曲和傳統(tǒng)成品大曲品質(zhì)具有顯著差異
TM和MM理化性質(zhì)和酶學特性研究表明，TM具有較高的還原糖（RS）、總酸（TA）、總酯（TE）含量和糖化活性，而MM具有較高的水分和酸性蛋白酶活性。而液化活性和酯化活性基本一致，均滿足釀酒用大曲的基本指標。代謝物檢測結(jié)果表明，氨基酸和吡嗪類物質(zhì)可能是傳統(tǒng)高溫大曲和機械高溫大曲的主要差異代謝產(chǎn)物。其中，TM和MM之間有30種差異揮發(fā)性有機物（P<0.05），TM中吡嗪類、苯二氮雜類和酸類含量均高于MM，而MM中酮類和醇類含量較高。TM和MM中蘋果酸（MA）、丁酸（BA）、琥珀酸（SA）、酒石酸（TA）、乳酸（LA）、乙酸（AA）、檸檬酸（CA）等7種有機酸含量差異顯著（P<0.05），是TM和MM質(zhì)量差異的潛在影響因素（Fig.1）。
Fig.1：不同工藝成品高溫大曲發(fā)酵參數(shù)（A）、酶活指標（B）及差異代謝物（C-D）
2.高溫大曲發(fā)酵參數(shù)和微生物群落的時間動態(tài)演替規(guī)律
大曲發(fā)酵理化參數(shù)表明，HTD-M溫度變化趨勢出與HTD-T相似，但HTD-T的溫度第7天達到峰值（64.5 ℃），HTD-M在溫度第15天達到峰值（62.0 ℃），現(xiàn)代機械壓榨使大曲塊擴散，影響發(fā)酵初期保溫。而發(fā)酵后期機械曲塊變得緊實，保溫性能提高，溫度上升速率快。水分含量持續(xù)下降至接近11%，傳統(tǒng)大曲在發(fā)酵前期水分散失速率快，而機械大曲水分則是在發(fā)酵后期散失速率更快。RS、銨態(tài)氮（TAN）、總酸（TA）、總酯（TE）含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且T40均顯著高于M40。此外，T40的糖化活性和酸性蛋白酶活性均高于M40，說明傳統(tǒng)發(fā)酵方式有利于HTD的碳氮代謝（Fig.2）。
Fig.2：曲房溫度（A），發(fā)酵參數(shù)（B）及酶活指標（C）隨發(fā)酵時間的動態(tài)規(guī)律
基于序列100%相似性標準共鑒定出16，166個細菌ASV和2，078個真菌ASV。T08中的Chao 1和Shannon指數(shù)均顯著低于M08中的Chao 1和Shannon指數(shù)（P<0.05），并且在發(fā)酵后期情況相反。同時，在發(fā)酵早期（溫度較低）HTD-M的真菌多樣性指數(shù)，而在發(fā)酵后期（溫度較高）HTD-M中該指數(shù)較低。以上結(jié)果表明，高溫對ASVs的獨特性和微生物多樣性有抑制作用，且溫度越高，趨同性越強（Fig.3）。
Fig.3：HTD發(fā)酵過程中細菌（A-B）和真菌（C-D）共有和特有的ASVs；細菌群落（E）和真菌群落（F）的α多樣性指數(shù)變化特征
微生物群落相對定量分析表明，HTD發(fā)酵過程中細菌群落變化顯著，優(yōu)勢屬主要為Staphylococcus、Lactococcus、Weissella、Kroppenstedtia、Bacillus和Virgibacillus。而真菌群落差異較小，主要是Thermomyces和Thermoascus。基于Bray-Curtis距離矩陣的PCA分析發(fā)現(xiàn)，由于初始發(fā)酵期間HTD-T和HTD-M之間的溫度差異，T08和M08樣品中細菌群落具有差異。而真菌群落沒有顯著差異，進一步說明細菌比真菌更容易受到外界環(huán)境因素的干擾。為深入了解群落差異化的原因，基于零模型分析β最近分類單元指數(shù)（βNTI），以生態(tài)位理論評估HTD-T和HTD-M群落組裝模式的差異，結(jié)果表明HTD-T發(fā)酵細菌群落是確定性組裝，而HTD-M峰溫滯后影響了初期細菌群落組裝模式，由隨機性組裝到確定性組裝。兩種模式下真菌群落都是隨機性組裝（Fig.4）。
Fig.4：高溫大曲發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)和組裝模式
3. 確定傳統(tǒng)與機械高溫大曲的靶標差異代謝產(chǎn)物
GC-MS在發(fā)酵大曲中共檢測到87種揮發(fā)性化合物（VOCs），HPLC定量檢測了大曲發(fā)酵過程的10種有機酸和17種氨基酸。通過投影變量重要度（VIP）分析，篩選到16種差異VOCs（VIP>1.2）、3種差異有機酸和7種差異氨基酸（VIP>1.0）。進一步的Venn分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵大曲差異代謝物與成品大曲差異代謝物存在14種共同的差異代謝產(chǎn)物，作為后續(xù)研究的靶標差異代謝產(chǎn)物（Fig.5）。
Fig.5：揮發(fā)性化合物（A），有機酸（B）和氨基酸（C）的含量動態(tài)變化熱圖與氣泡圖以及基于VIP篩選的差異代謝標志物瀑布圖（D）
4. 鎖定靶標差異化合物代謝潛在的ASV水平微生物
靶標差異代謝產(chǎn)物與優(yōu)勢ASVs的Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，Bacillus、Virgibacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Monascus被認為是造成傳統(tǒng)高溫大曲和機械高溫大曲代謝表型差異的核心物種，相應地，BA、精氨酸（Arg）、四甲基吡嗪（TTMP）、三甲基吡嗪（TMP）和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4-VG）被篩選為可調(diào)控的靶標差異代謝產(chǎn)物（Fig.6）。
Fig.6：核心ASVs與目標代謝物之間基于顯著相關(guān)性的網(wǎng)絡圖
5.從基因?qū)用骝炞C引起目標代謝物差異的潛在微生物
為了進一步揭示大曲風味物質(zhì)的形成過程，基于KEGG（16S rRNA）和MetaCyc（ITS rRNA）數(shù)據(jù)庫，對大曲微生物的功能譜進行預測。同時，利用PICRUSt 2預測了細菌和真菌群落中相關(guān)酶功能基因的豐度變化。此外，我們關(guān)注來自18個ASV的酶分布，因為它們可能參與與風味化合物相關(guān)的主要代謝途徑，包括Arg代謝、BA代謝、4-VG代謝和十六烷生物合成（Fig.7）。
Fig.7：PICRUSt2預測的精氨酸、丁酸、四甲基吡嗪和2-乙烯基愈創(chuàng)木酚代謝通路示意圖。熱圖表示核心ASVs中與上述代謝途徑相關(guān)酶的基因相對豐度
6. 探索高溫大曲中驅(qū)動核心ASVs代謝的生物和非生物因素
18個核心ASVs的共線性網(wǎng)絡分為兩個模塊，模塊Ⅰ中，9個與Arg正相關(guān)的ASVs之間存在協(xié)同效應，而與BA、TTMP、TMP、4-VG呈正相關(guān)的9個ASVs構(gòu)成模塊Ⅱ中的正相關(guān)網(wǎng)絡模式。一方面，兩個模塊的ASVs均受到溫度、TA和RS的正向驅(qū)動；另一方面，水分和淀粉與大多數(shù)ASVs呈負相關(guān)。上述結(jié)果綜合表明，造成代謝差異的ASVs具有良好的耐高溫和耐酸特性，同時具有優(yōu)異的原料分解和利用能力，且低水分環(huán)境下能更好的發(fā)揮作用（Fig.8）。
Fig.8：核心ASVs的共線性網(wǎng)絡（A）以及發(fā)酵因子對核心ASVs的冗余分析（B-C）
PART 4、研究結(jié)論
1.在這項研究中，證明機械壓榨擴散大曲是溫度管理模式差異的初始原因，它改變了微生物的組裝模式和代謝表型。Arg、BA、TTMP、TMP、4-VG可能是影響大曲質(zhì)量的目標關(guān)鍵代謝物。Bacillus、Virgibacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Monascus是影響代謝變異的主要微生物。高溫、高酸和低水分可能是導致熱脫附過程中特征風味代謝的主要因素。
2.以上發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解機械熱處理中外部發(fā)酵環(huán)境改變微生態(tài)分化的機制，為更好地管理和提高熱處理質(zhì)量的新策略奠定理論基礎(chǔ)。同時，進一步通過宏轉(zhuǎn)錄組學和宏蛋白質(zhì)組學解鎖HTD微生物區(qū)系功能的更多機制，為HTD質(zhì)量改進可提供更多信息和思路。
原文引用：Gailing Shi, Chao Fang, Shuang Xing, Ying Guo, Xin Li, Xiao Han, Liangcai Lin, Cuiying Zhang, Heterogenetic mechanism in high-temperature Daqu fermentation by traditional craft and mechanical craft: From microbial assembly patterns to metabolism phenotypes, Food Research International, Volume 187, 2024, 114327, ISSN 0963-9969.
原文鏈接：DOI: 10.1016/j.foodres.2024.114327
