2024-04-10
文章題目: Microenvironment-responsive metal-phenolic network release platform with ROS scavenging, anti-pyroptosis, and ECM regeneration for intervertebral disc degeneration
技術(shù)手段：轉(zhuǎn)錄組測序、SEM 和TEM、細胞活性評估、熒光染色、RT-qPCR等
中南大學湘雅三醫(yī)院，鄧幼文教授團隊在《Bioactive Materials》上發(fā)表了基于當前IVDD的治療困境，創(chuàng)新性的開發(fā)了一款多功能微環(huán)境響應型的金屬酚網(wǎng)絡釋放平臺的研究成果。
本研究的轉(zhuǎn)錄組測序和部分數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
椎間盤退變(IVDD)是一種以一系列病理改變?yōu)樘卣鞯膹碗s疾病，對生活質(zhì)量和健康產(chǎn)生負面影響，雖然保守治療可以有效緩解疼痛，但并不能減緩IVDD的進展因此，單靶點治療是不夠的。因此，為了有效治療IVDD，迫切需要開發(fā)多靶點藥物治療。
越來越多的證據(jù)表明，IVDD與氧化應激產(chǎn)生、細胞焦亡和細胞外基質(zhì)(ECM)降解密切相關(guān)。活性氧(ROS)過量，主要由線粒體產(chǎn)生，可引起組織損傷。
本研究擬通過以TA（單寧酸）、錳和聚乙烯吡羅烷酮(PVP)為原料，通過自組裝，開發(fā)具有高效ROS清除活性的TA衍生金屬-酚類網(wǎng)絡(TA- mn -PVP, TMP)，并評估其對IL-1β誘導的IVDD的療效。
平臺制備方法、椎間盤注射及治療效果示意圖
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1.能量代謝產(chǎn)物和酶活性的變化
為了更好地了解IVDD發(fā)病時組織發(fā)生的病理變化，本研究收集了IVDD患者的髓核組織標本。通過MRI圖像，番紅-固綠染色，免疫組織化學，半定量以及IVD組織中關(guān)鍵的焦亡相關(guān)蛋白的表達評估等方法，這些結(jié)果均表明，焦亡促進了IVDD的進展。ROS與焦亡和ECM降解密切相關(guān)，并在IVDD的發(fā)展中也起著同樣重要的作用（圖1）。另外活性氧的存在促進細胞焦亡和ECM降解。因此，去除活性氧在治療IVDD中同樣至關(guān)重要。
圖1：臨床退行性髓核組織標本的病理改變
2.TMP 納米顆粒的表征
本研究利用FTIR光譜，SEM 和TEM，元素圖譜顯微鏡，熱重分析，全掃描 XPS 測量光譜等表征測定（圖2），TA-Mn金屬多酚網(wǎng)絡具有合成步驟簡單、成本效益高且易于執(zhí)行對的特點，因此它非常適合大規(guī)模合成。
圖2：TMP納米顆粒的合成與表征
3.TMP清除ROS的活性能力
在表征 TMP NP后，進一步探討了它們的 ROS 清除能力。TMP NPs 表現(xiàn)出濃度依賴性的自由基清除速率和能力（圖3A-D）。
在化學水平上表征了納米粒子對 ROS 的 ROS 清除性能后，本研究還觀察了細胞中的 ROS 清除性能。在本研究中，IL-1β刺激導致細胞產(chǎn)生過量的ROS，這一點通過氧化應激探針（DCFH-DA）得到證實；相反，與TMP NPs一起孵育后，熒光顯著減弱，并且隨著TMP NPs濃度的增加，ROS熒光進一步減弱。半定量分析證實了納米顆粒具有很強的 ROS清除特性（圖3E-K）。
以上結(jié)果均證實了NPs改善了線粒體活性。
圖3：TMP納米顆粒ROS清除活性
4.TMP@Alg-PBA/PVA 水凝膠釋放平臺的表征
本研究用FTIR 分析，SEM分析，流變學表征和凝膠降解測試等方法證明了該釋放平臺的特性有望用于IVD 注射（圖4）。
圖4：TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺的表征
5.TMP NP 的細胞攝取、溶酶體逃逸和線粒體積累
細胞攝取納米粒子的效率對于治療效率至關(guān)重要。本研究通過將TMP NP附著在 CY5 熒光上并加載到水凝膠中，觀察負載濃度和納米粒子的吸收效率，并進一步通過細胞活、死染色以及溶血實驗證實了100 μg/mL和 200 μg/mL NP的TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠表現(xiàn)出良好的生物相容性。
半定量分析，流式細胞術(shù)，線粒體追蹤器熒光標記等一系列實驗表明納米粒子被細胞吸收后，可以通過溶酶體逃逸釋放到細胞質(zhì)中，然后靶向線粒體區(qū)域，以促進TMP更有效地清除ROS（圖5）。
圖5：MP納米顆粒的細胞攝取、溶酶體逃逸和線粒體積累
6.TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺對體外細胞焦亡的影響
ROS的積累和線粒體毒性可以通過多種途徑介導細胞焦亡。IL-1β是一種極具代表性的促炎因子，用CCK-8 檢測試劑盒來量化 IL-1β 對 NPC 死亡的影響。圖6A顯示了水凝膠與NPC共培養(yǎng)的可視化表示。對每組進行了CCK-8測定，結(jié)果表明與Gel組和對照組相比，處理組的細胞活性以濃度依賴性方式顯著提高（圖6B），PI 染色實驗表明凝膠組和對照組的死細胞數(shù)量明顯高于空白組（圖6C）。
細胞膜破裂和裂解代表了細胞焦亡的關(guān)鍵特征LDH 檢測試劑 盒顯示對照組和凝膠組的LDH水平顯著增加。相反，TMP@AlgPBA/PVA組表現(xiàn)出LDH積累減少，表明細胞膜破裂減少（圖6D）。此外， SEM顯示IL-1β組細胞膜表面的孔數(shù)量顯著增加，并伴有碎片細胞膜上的球狀突起。相反，處理組和空白組的細胞形態(tài)表現(xiàn)出伸長和堅固的細胞膜完整性（圖6E）。
推論該平臺可能通過抑制細胞焦亡來減輕上述現(xiàn)象，并通過RT-qPCR實驗，在基因水平上，與其他組相比，治療組IL-1β和TNF-α mRNA的表達顯著降低（圖6F），在蛋白質(zhì)水平上，免疫熒光評估了與細胞焦亡相關(guān)的經(jīng)典蛋白質(zhì)的表達，證明了該平臺的抗焦亡特性。蛋白質(zhì)印跡分析也證實了相同的結(jié)論（圖6H）。
圖6：TMP@Alg-PBA/PVA對焦亡的影響
7.TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺制造細胞焦亡的潛在機制
為了評估NPC基因表達的變化，進行了高通量 mRNA測序來分析細胞內(nèi)mRNA的變化（圖7A）。治療組與IL-1β組進行比較時，1472個基因上調(diào)，1495個基因下調(diào)（圖7B），差異基因GO富集分析結(jié)果顯示DEGs主要與發(fā)育過程、細胞對化學刺激的反應、細胞分化、ECM、含有膠原蛋白的細胞外空間、蛋白質(zhì)或信號通路結(jié)合和激活有關(guān)。KEGG富集分析結(jié)果顯示治療組中TNF信號通路、IL-17信號通路、細胞周期和Toll樣受體信號通路的下調(diào)（圖7D）。IL-17信號通路被顯著抑制（圖7E）。
作者進一步用WB測定驗證了IL-17誘導的細胞焦亡相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達（圖7F）。綜上，這些結(jié)果表明 TMP@Alg-PBA/PVA 可能通過抑制 NPC中的 IL-17/ERK信號通路來減少細胞焦亡，從而為 IVDD治療提供新的可能靶點。
圖7：轉(zhuǎn)錄組測序分析以及WB驗證
8.TMP@Alg-PBA/PVA處理后ECM的變化
作者利用IL-1β刺激NPC并模擬炎癥環(huán)境對ECM的影響。這些結(jié)果表明，TMP@Alg-PBA/PVA 平臺抵消了IL-1β對ECM的有害影響，顯示出IVD修復和再生的前景（圖 8）。
圖 8. 炎癥環(huán)境中 TMP@Alg-PBA/PVA 對 ECM 的影響
研究結(jié)論
在這項研究中，作者開發(fā)了一個多功能和微環(huán)境響應的金屬-酚網(wǎng)絡釋放平臺(TMP@Alg-PBA/PVA)，該平臺裝載了TMP NPs，體外研究表明，該平臺釋放的金屬-酚網(wǎng)絡(TA-Mn-PVP, TMP)靶向線粒體，有效清除ROS，減少ECM降解。通過抑制IL-17/ERK信號通路抑制焦亡。這些發(fā)現(xiàn)證明了該平臺的多功能性。另外在IVDD大鼠模型中，TMP@Alg-PBA/PVA通過減緩疾病進展表現(xiàn)出優(yōu)異的治療效果（圖9.10.11）。
總體而言，該平臺具有治療IVDD的治療潛力，值得進一步系統(tǒng)的臨床前研究。IL-17/ERK信號通路作為該平臺對IVDD影響的分子因子的鑒定進一步提供了治療焦亡的潛在靶點。
