2024-01-30
近日，江蘇大學附屬人民醫(yī)院在《Human Genomics》發(fā)表新研究成果！本文研究從發(fā)炎的眼部分離出的菌株巴西副塵孢菌P. brasiliense GGX 413，組裝出GGX 413的基因組，并從遺傳學角度研究了GGX 413的毒力因子、CAZymes、肽酶、次級代謝產(chǎn)物和其他基因產(chǎn)物，篩選其基因組中與人類疾病相關(guān)的致病基因，有助于未來研究GGX 413和其他真菌在人類中的潛在致病機制。
本研究的測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景 Paraconiothyrium屬包括27個種，該屬通常被描述為含有植物病原體和人類機會性病原體。2004年巴西的M.Taniwaki首次從阿拉伯咖啡果實中分離出P.brasilianse，并由Verkley等人首次描述。像其他Paraconiothyrium屬物種一樣，P.brasilianse具有多種生物活性，在許多領域中具有潛在的應用前景。例如，從喜馬拉雅紫杉中分離出的P.brasilianse產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的紫杉醇。Arredondo Santoyo等人指出從元寶楓中分離得到的四種三環(huán)倍半萜對人免疫缺陷病毒1（HIV-1）表現(xiàn)出有效的活性。Afshan第一個報道P.brasiliense在巴基斯坦引起柳葉野扇花葉斑病，但目前還沒有關(guān)于P.brasilianse在人類中引起疾病的報道。 在這項研究中，在一名左眼瞼樹枝損傷的患者中分離出一種致病性P.brasilianse菌株，該菌株會導致蜂窩組織炎。為研究其發(fā)病機制，從蛋白質(zhì)組學和病原菌的轉(zhuǎn)錄組學進行了研究，采用二代測序和三代測序技術(shù)對其全基因組進行了測序。基于全基因組序列進行了生物信息學分析，包括蛋白質(zhì)編碼基因的功能注釋、分類鑒定、致病因子的預測以及重復序列和非編碼RNA（ncRNA）的分析。
02、研究材料與方法 1.實驗材料： P. brasiliense GGX 41, 是一種火焰狀真菌。 2.測序平臺 Illumina NavoSeq（二代）+Nanopore（三代） 3.分析內(nèi)容 基因組組裝+注釋、ITS進化樹、基因家族分析、單拷貝進化樹、特有基因功能分析等。
03、研究結(jié)果 分離菌株的形態(tài)與鑒定 患者被診斷為左眼瞼蜂窩組織炎，由一種火焰狀真菌引起，其菌絲體呈隔膜狀（圖1A和B）。SDA培養(yǎng)基上的真菌菌落是圓形的，邊緣整齊，凸起度低，菌落表面均勻到略呈褐色，被氈質(zhì)焦斑覆蓋。菌落邊緣白色，從邊緣到中心變暗，氣生菌絲由白色變?yōu)樯詈稚＞涞闹睆皆?天后為16毫米（圖1C），在8天后為42毫米（圖1D），在12天后為60毫米（圖1E）。根據(jù)感染患者的信息，將火焰狀真菌命名為GGX 413。 圖1 火焰狀真菌的形態(tài)學 GGX 413基因組組裝和特征分析 通過二代+三代測序數(shù)據(jù)組裝GGX 413基因組，共獲得11個scaffolds，39.49Mb的基因組序列，GC含量為51.2%。最小和最大序列長度分別為0.24Mb和5.24Mb，N50為4.62Mb。包含13,057個蛋白編碼基因，總長度20.17Mb（占比51.1%）。共預測了181個ncRNA，ncRNA的平均長度和總長度分別為514.2bp和93073bp，占全基因組的0.24%。基因組的詳細特征如圈圖所示（圖2）。 圖2 P. brasiliense GGX 413基因組圈圖和詳情統(tǒng)計表 GGX 413物種進化關(guān)系 基于GGX 413的552bp的ITS序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，使用與GGX 413相似性>90%的代表性序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并使用蠕蟲孢菌（AF145704）和茄長蠕孢（AF163089）的ITS序列作為外群（圖3）：GGX 413屬于巴西副錐藻群，bootstrap值為93%，表明進化關(guān)系是可靠的。還基于10個物種的4995個單拷貝基因家族生成系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定它們與GGX 413的基因組相似性（圖4），GGX 413與從杏樹中分離出的P.brasiliense M42-189和從中國白蠟介殼蟲中分離出來的Paraconiothyrium sp.Pb-2020密切相關(guān)。 圖3 23個真菌ITS進化樹 圖4 10個真菌單拷貝基因進化樹 致病性相關(guān)基因的預測 PHI數(shù)據(jù)庫共注釋出2,905個（22.2%）基因，分為八組（圖5），共有1,579個基因與毒力有關(guān)。DFVF數(shù)據(jù)庫注釋毒力因子相關(guān)基因，共1,186個（9.08%）基因與疾病相關(guān)（圖6A和B）。篩選可能導致人類疾病的高毒力或致命毒力因子的基因（圖6C），592個參與人類疾病的基因中有61個編碼致死毒力因子，其中30個編碼高通氣因子。分析編碼與人類疾病相關(guān)的毒力因子（DFVF-HUM）的基因的GO功能注釋（圖6D）：525個基因參與“分子功能”，其次是“生物過程”（483）和“細胞成分”（370）。這些基因主要分布在“發(fā)病機制”（311）、“ATP結(jié)合”（153）和“菌絲生長”（129）中。 圖5 菌GGX 413基因組中基因的PHI注釋功能分類統(tǒng)計 圖6 菌GGX 413基因組中編碼DFVF-HUM的基因分析 GGX 413基因組中編碼蛋白基因的KOG和KEGG功能注釋 KOG共注釋出11,000個基因，占GGX 413基因組ORF的84.2%（圖7）。結(jié)合人類疾病的毒力因子數(shù)據(jù)，27個編碼DFVF-HUM的基因參與了次級代謝產(chǎn)物的合成。 KEGG共注釋出4,104個基因，占ORF總數(shù)的31.4%，參與462個KEGG途徑（圖8）。結(jié)合人類疾病的毒力因子數(shù)據(jù)進行了進一步的分析，結(jié)果表明編碼DFVF-HUM的四個基因參與了萜類代謝。這四個基因中有兩個編碼的蛋白質(zhì)是乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶，另外兩個基因編碼甲羥戊酸激酶和角鯊烯單加氧酶。 圖7 菌GGX 413基因組中基因的KOG注釋分析 圖8 菌GGX 413基因組中基因的KEGG注釋分析 與人類疾病相關(guān)的分泌組和分泌肽酶的測定 分泌蛋白預測出841個分泌蛋白，其中278個基因編碼92種與人類疾病有關(guān)。MEROPS數(shù)據(jù)庫預測有1,853個基因參與肽酶合成。比較分泌組、肽酶和DFVF-HUM的基因序列，篩選與人類致病性相關(guān)的分泌肽酶（圖9A）。肽酶和DFVF-HUM之間共有119個基因，分泌組、肽酶和DFVF-HUM中共有70個基因，這表明119個基因編碼的肽酶參與人類疾病，其中70個是分泌的。這些肽酶根據(jù)其催化類型分為五類（圖9B），最豐富的絲氨酸肽酶和金屬肽酶分別是枯草桿菌蛋白酶亞家族（8A）和氨基肽酶Y（M28）家族（圖9C）。 圖9 菌GGX 413基因組中與人類疾病相關(guān)的分泌肽酶編碼基因分析 CAZymes數(shù)據(jù)庫注釋分析 共注釋出826個編碼CAZymes的基因和15個編碼碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）的基因，占比6.44%。通過比較分泌組、CAZymes和DFVF-HUM的基因序列，Venn圖顯示，54個基因在CAZymes和DFVF-HUM間共有，46個基因在分泌組、CAZyme和DFVF-HUM間共有。這表明由54個基因編碼的CAZyms對人類疾病有貢獻，其中46個具有分泌特性（圖10A），和CE家族（圖10B），GO功能分析表明，這些CAZymes在轉(zhuǎn)移己糖基和糖基、水解O-糖基化合物和離子結(jié)合方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用（圖10C）。 圖10 菌GGX 413基因組中與人類疾病相關(guān)的分泌型CAZymes基因的分析 GGX413特有基因家族分析 通過對7個親緣關(guān)系密切的菌株的基因家族的分析，鑒定了GGX 413的特有基因（圖11），并對其GO功能進行了富集分析。GGX 413特有的355個基因家族，共包含357個基因。GO富集分析表明，GGX 413的特有基因主要與RNA生物合成和代謝過程的調(diào)控有關(guān)。還分析了GGX 413毒力因子的特異性。并與巴西假單胞菌M42-189和副錐藻的毒力因子進行了比較。在Pb-2020中，檢測到五種特定毒力因子，其中三種（Q59RW3-CANAL、CARP3-CANAL和A6ZLA2_ YEAS7）與人類傳染病有關(guān)（圖12）。 圖11 基因家族聚類分析 圖12菌GGX 413特有毒力因子分析
04、研究結(jié)論 1.利用全基因組測序技術(shù)對GGX 413的基因組進行組裝注釋，為研究其基因組的結(jié)構(gòu)特征和功能提供了基礎。 2.從遺傳學角度研究了GGX 413的毒力因子、CAZymes、肽酶、次級代謝產(chǎn)物和其他基因產(chǎn)物，并篩選了其基因組中與人類疾病相關(guān)的致病基因，有助于未來研究GGX 413和其他真菌在人類中的潛在致病機制。
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文章索引：Liu, H.B.,Zhang, Y., Chen, J.Gl. (2023).Whole-genome sequencing and functional annotation of pathogenic Paraconiothyrium brasiliense causing human cellulitis[J].Human Genomics. doi.org/10.1186/s40246-023-00512-5.
