2022-08-22
《Aob Plants》
影響因子：3.318
近日，派森諾生物與四川大學生命科學院合作，在生物學領域的《Aob Plants》發表新研究成果！本研究對芹亞科7個物種的葉綠體基因組進行了測序，結果表明擬藁本屬的9個物種在芹亞科內形成了一個高度支持的單系分支。擬藁本屬是一個完全獨立的自然屬級分類群，屬間形態特征界限清晰，應與藁本屬分開。
研究背景
1969年，Leute對中國高海拔地區幾個Ligusticum（藁本屬）物種開展植物學研究，依據分果瓣類型與“Ligusticeen-Typ”明顯對應但與已知類型不同，首次創立了Ligusticopsis（擬藁本屬，芹亞科）。Pimenov等人依據果實解剖結果同樣支持擬藁本屬的建立，并進行了多次分類學修訂。擬藁本屬的分類一直存在爭議，許多植物學家沒有將擬藁本屬作為一個單獨的屬，因為擬藁本屬和臨近屬之間沒有明確的形態界限。此外，Leute將幾個沒有明顯萼齒的物種納入擬藁本屬模糊了該屬的邊界。隨著分子系統發育的進展，一系列研究表明，藁本屬和藁本屬都不是單系的，而且屬與某些物種之間的支持不足以相互區分。因此，基于核基因區域的低分辨率系統發育關系需要額外的DNA數據集來澄清。而葉綠體為母系遺傳，具有高度保守的基因含量和基因組結構，并且具有更多的可變位點，是系統發育重建和復雜進化關系解析的重要資源。本研究通過添加新測序的7個葉綠體和11個ITS序列，分析了傘形科芹亞科34個葉綠體和35個ITS序列，將系統發育結果與果實分類學和葉綠體基因組比較分析相結合，重建擬藁本屬的系統發育關系，并研究擬藁本屬從藁本屬分開的根本原因。
研究材料與方法
1、實驗材料
從芹亞科內的藁本屬、擬藁本屬和亮蛇床屬等三個屬中共采集了11個野生物種用于ITS測序、其中的7個物種進行葉綠體基因組測序
2、測序平臺
Illumina NovaSeq
3、分析內容
植物葉綠體基因組測序、IR區收縮與擴張分析、RSCU分析和系統發育樹分析
研究結果
1、七個新物種的葉綠體基因組組裝注釋
七個新測序的完整葉綠體序列的長度范圍從148,005 bp（L. acuminata）到163,810 bp（L. angelicifolia）。所有葉綠體基因組均顯示出典型的四分體結構，一對IR區由LSC區（76,900-93,725 bp）和SSC（17,464–18,495 bp）分開。L. angelicifolia的葉綠體基因組（163,810 bp）和IR區（34,723 bp）是7個葉綠體中最長的，但LSC區卻最短（76,900 bp）。7 個葉綠體的全基因組、LSC、SSC和IR區的GC含量不同，IR區檢測到的GC含量（40.8–44.8%）高于其他區域（LSC，35.8–36.0%；SSC， 30.8–31.1%）。除L. angelicifolia外，其余6個新的葉綠體基因組共有128個基因，包含84個CDS、36個tRNA、8 個rRNA和兩個假基因（ψycf1 和 ψycf2）。 L. angelicifolia 葉綠體基因組包含143個基因，其中98個CDS、37個tRNA、8個rRNA和一個假基因（ψycf1）。
表1 七個新測序葉綠體基因組特征比較
2、系統發育分析
基于34個葉綠體單拷貝CDS序列兩種不同分析方法（ML和BI）下的系統發育分析結果，七個主要族（其中包括Leute鑒別的擬藁本屬物種）都不是單系的，它們屬于Hymenidium分支以及Selineae。在Selineae內，L. angelicifolia、L. thomsonii、五個Angelica物種和Glehnia littoralis聚集到一個進化支中，在ML樹中具有中等支持率，在BI樹中具有高支持率（BS=77%，posterior probabilities [PP]=0.92）。Ligusticopsis brachyloba、L. capillacea、L. rechingerana（擬藁本屬的典型種）、L.modesta、L. integrifolia和L. scapiformis與L. involucratum、L. hispidum和S. wallichianum形成一個分支（Subclade A），且具有強烈的支持（BS=100%，PP=1.00），并且位于該分支的所有物種都被Pimenov視為“真正的Ligusticopsis”。在Subclade A內，L. brachyloba和S. wallichianum形成一個分枝（BS=100%，PP=1.0），是其他七個物種的姐妹。Ligusticopsis rechingerana是L. involucratum的姐妹，并與L. hispidum構成一個強烈支持的分支（BS=100%，PP=1.00），該分枝是其他4物種的姐妹在ML中中等支持（BS=72%），但在BI中支持很弱（PP=0.55）。Ligusticopsis capillacea是L. scapiformis和L. integrifolia也是L. meadowa的姐妹，這兩個姐妹分支分別有很強的支持（BS=100%，PP=1.00）。此外，L. acuminata，L. tenuisecta和L. pteridophylla位于Hymenidium分支中。Ligusticopsis acuminata和L. tenuisecta是姐妹物種，并與三個Ligusticum物種聚集形成強烈支持的進化支（Subclade B）（BS = 100 %， PP = 1.00）。在Subclade B內部，L. sinense和L. jeholense是姐妹物種（BS=100%，PP=1.00），該分支為L. acuminata和L. tenuisecta的姐妹分支（BS=100%，PP=1.00），而L. tenuissimum是上述四個物種的姐妹（BS=100%，PP=1.00）。Ligusticopsis pteridophylla屬于Hymenidium分支在其自己的分支中，它被確定為Hymenidium分支和Selineae中其他物種的姐妹（BS=100%，PP=1.00）。Ligusticum delavayi是M. yunnanensis的姐妹物種，位于Acronema分支中，具有強烈的支持（BS=100%，PP=1.00），是Hymenidium分枝和Selineae的外群之一。
基于傘形科芹亞科的35個nrITS的系統發育樹中存在類似的拓撲結構，但一些物種的系統發育位置不同，一些分支的支持較弱。Ligusticopsis pteridophylla不再是Hymenidium進化枝和Selineae的姐妹，而是在Hymenidium進化枝內與L. sinense和L. jeholense形成姐妹分支（BS=94%，PP=1.00）（Subclade B）。Ligusticum thomsonii不與Angelica物種聚集，但它是Subclade A的姐妹，具有強烈支持（BS=92%，PP=1.00）。在Subclade A內，L. modestaL與L. integriflia聚集但支持率很低（BS=35%），這里的L. hispidum是L. meadowa和L. integrifolia的姐妹，但支持率也很低（BS=33%），而L. involucratum是這三個物種的姐妹，但支持率高（BS=96%，PP=0.91）。L. capillacea和其他四種植物（L. involucratum、L. hispidum、L.modesta和L. integrifolia）之間的分枝上出現弱支持（BS=57%），然后是L. rechingerana是這五個物種的姐妹，得到了高支持率（BS=87%，PP=0.93）。Ligusticopsis scapiformis是上述6個物種的姐妹，具有高支持率（BS=93%，PP=1.00）。
圖1 由BI和ML構建的芹亞科的系統發育樹
3、葉綠體基因組比較分析
通過比較IR區邊界基因的分布發現，Subclade A和Subclade B以及其他三個質體之間的主要區別是IRa/LSC邊界（JLA）和LSC/IRb邊界（JLB）的基因分布。trnH基因區域位于JLA系附近，在亞進化枝A中，trnH基因到JLA系的距離相同（6 bp），而在亞進化枝B和其他三個質體中該距離更長且不同。除了L. angelicifolia和L. tenuissimum，在JLB系和JLA系的其余15個質體中發現了類似的結構，但有一些變化。JLB系將576-585 bp延伸到Subclade A中的ycf2基因中，比Subclade B（659–701 bp）、L. pteridophylla （701 bp）和L. thomsonii （694 bp）的相應區域短。Subclade A中trnL基因到JLA系的距離（1809–2177 bp）比亞進化枝B的相應區域（1331–1345 bp）、L. pteridophylla（1045 bp）和L. thomsonii（1033 bp）長。Ligusticopsis angelicifolia具有最長的IR區域，使得IRb區域向LSC區域擴展至petB基因的位置；因此，JLB系將1084 bp延伸到petB基因中。L.tenuissimum的IRb區域也顯示向LSC區域擴展，但JLB系僅擴展到rpl22基因的位置，并且rpl22基因跨越JLB系，在IRb區域有2 bp的延伸。
圖2 IR區的收縮與擴張分析
通過對17個葉綠體基因組中53個CDS密碼子使用分析。這些CDS編碼21,585-21,749個密碼子，亮氨酸（Leu）的密碼子數量最多，而半胱氨酸（Cys）的密碼子數量最少。甲硫氨酸（Met）的密碼子ATG和色氨酸（Trp）的密碼子TGG在所有質體中的RSCU值為1.0，其中1.0的RSCU值表示沒有密碼子使用偏差。30個密碼子的RSCU值>1.0并且除了Leu的TTG外，所有密碼子都在第三位具有A/T。在三種類型的終止密碼子中，Subclade A在TAA中具有相同的密碼子偏好（RSCU=1.75），高于Subclade B和其他三種質體。這是Subclade A和其他質體之間的主要區別，而其他兩種類型的終止密碼子（TAG和TGA）的RSCU<1.0并且在葉綠體基因組之間有所不同。其他61種密碼子在不同物種中具有相似的RSCU值。
圖3 17個質體的53個PCG的同義密碼子使用（RSCU）值
此外，對17個物種完整葉綠體基因組比較分析。結果表明，編碼區比非編碼區有更高的序列保守性。在Subclade A中，一些高度分化的區域（例如trnH-psbA、ycf1、ycf2、rpoC2、rpl32、psaB、ndhF）具有高度相似性，但與Subclade B和其他三個葉綠體基因組相比，相應區域存在顯著差異。
4、分果瓣形態學
Subclade A的七個物種包括L. rechingerana、L. integrifolia、L. moderatea、L. capillacea、L. hispidum、L.involucratum和S. wallichianum，分果瓣橢圓形或卵形，胚乳接合面扁平，具萼齒，絲狀或龍骨狀中肋和側肋，邊緣肋具翅，在接合處（4-8）和每個棱槽（1-4）有許多油管。Selineae的Ligusticopsis angelicifolia分果瓣橢圓形，胚乳連合面微凹，無萼齒，中肋和側肋具狹翅，邊緣肋具翅，在接合處（5-8）和每個棱槽（2-4）有許多油管。Hymenidium分枝的Ligusticopsis tenuisecta和L. pteridophylla分果瓣在種面稍凹，中肋和側肋有翅，但這兩個物種的分果瓣除了具有相同的特征外，還存在一些差異。Ligusticopsis tenuisecta有倒心形的分果皮，所有油管都沒有，而L. pteridophylla有卵形或圓形的分果瓣，在接合處（4）和每個棱槽（2-3）有許多油管。
結 論
本研究基于新測序的7個葉綠體基因組和11個ITS序列，重建了擬藁本屬的系統發育關系。系統發育結果支持Pimenov之前的分類處理，同時Ligusticopsis是一個完全獨立和自然的屬級分類群，應與Ligusticum分開。
本研究的denovo測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Zi-Xuan Li, Xian-Lin Guo, Megan Price, Song-Dong Zhou, Xing-Jin He, Phylogenetic position of Ligusticopsis (Apiaceae, Apioideae): evidence from molecular data and carpological characters, AoB PLANTS, Volume 14, Issue 2, April 2022, plac008, https://doi.org/10.1093/aobpla/plac008
