2022-06-21
《Carbohydrate Polymers》
影響因子：9.381
派森諾與華中農業大學攜手合作，在國際著名雜志《Carbohydrate Polymers》發表了殼寡糖增強魚類體液免疫的細胞和分子機制。
技術路線
研究背景
殼寡糖（Chitosan Oligosaccharide，COS）是由2-10個氨基葡萄糖經β-1, 4糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖，來源于蝦蟹殼，純天然、無毒害、分子量小、水溶性高、易被機體吸收利用，可作為飼料添加劑顯著提高畜、禽、水產動物的免疫力和抗病力并促進動物生長。目前研究更多聚焦于殼寡糖對動物先天性免疫細胞（如巨噬細胞和樹突狀細胞）的激活，很少關注殼寡糖對適應性免疫細胞（如B細胞）的活化作用。
研究材料與方法
1、實驗材料
人工養殖草魚（100-150g）
2、測序平臺
Illumina NovaSeq
3、分析方法
轉錄組測序，流式分選，TEM，ELISA，WB，qPCR等。
研究結果
1.COS誘導脾臟IgM+ B細胞增殖分化
為了研究草魚體內的殼聚糖反應性B細胞，從不同免疫組織中分離出白細胞，用不同分子量殼聚糖刺激，分析其對IgM+ B細胞的影響。增殖實驗結果表明，在COS(圖1E-G)刺激下，IgM+B細胞仍具有增殖活性，進一步表明COS誘導的IgM+ B細胞不是終末分化B細胞。
圖1
2.COS誘導天然IgM的產生與濃度和時間呈正比
本研究分離了草魚B細胞，用不同濃度的COS刺激B細胞（10、20、40μg/ml），以20μg/ml內毒素為陽性對照。在mRNA和蛋白水平上檢測IgM的產生，結果表明，COS組的IgM 表達顯著上調，且與濃度和時間呈正比，而LPS組的IgM表達無明顯變化(圖2A-C)。此外，還發現COS誘導的IgM能有效地與內毒素和PGN結合，但不能與Poly I:C結合(圖2D)，這表明COS誘導產生的IgM與哺乳動物分泌的天然IgM是一樣的。
圖2
3.CoS誘導的漿細胞IgMlo B可主導天然IgM抗體分泌
為了進一步研究COS誘導后兩個不同的IgM+B細胞亞群的表型和功能，對脾臟的IgMlo 、IgMhi 以及IgM?進行了細胞分選(圖3A)。此外通過超微結構分析，表達量分析以及抗體分泌等多方面研究(圖3)，這些結果共同證實了IgMlo B細胞類似于漿細胞，而IgMhi B細胞類似于初始B細胞。
圖3
4.COS在IgM+ B細胞上的潛在受體及其下游信號通路
為了探討B細胞表面COS受體及其下游調節IgMlo B細胞增殖和分化的信號通路，本研究從轉錄組角度分析了IgMlo 、IgMhi 以及IgM?細胞，結果表明， IgM+ vs IgMlo 差異基因相對于IgM+ vs IgMhi中要多，然后對上調DEGS進行GO和KEGG富集分析，發現IgMlo中上調DEGS主要富集在細胞周期信號通路和Rap1信號通路，由于Rap1信號通路可以介導整合素的激活，因此我們分析了整合素在IgMlo 、IgMhi 以及IgM?細胞中的表達水平。如圖4A所示，整合素的多個亞基在IgMlo B細胞中高表達，除了整合素外，PRR，MR也在IgMlo B細胞中也高表達(圖4A)。研究推測MR和整合素是B細胞表面COS的受體，誘導細胞增殖和分化。
圖4
5.COS與MR和整合素相互作用促使IgM+B細胞的鈣激活
前人研究表明，MR和整合素可以作為鈣離子信號受體。為了探討COS結合的MR和整合素信號轉導是否由細胞內鈣離子介導，如圖5所示，COS誘導引起細胞內鈣離子水平升高，但是這一作用幾乎完全被MOS和RGD所抑制。這些發現表明，整合素可能是COS在B細胞上更重要的靶點，它介導了細胞內鈣離子作為第二信使的動員，激活了下游的信號通路。
圖5
6.脾臟IgMlo B細胞可遷移到血液中分泌天然IgM
為了進一步研究COS是否能在體內誘導IgMlo B細胞增殖，進行了腹腔注射實驗，動態監測不同時間點IgMlo和IgMhi B細胞亞群的變化。結果表明，血液中IgMlo B細胞的出現時間晚于脾臟，因此推測血液中的IgMlo B細胞可能是從脾臟中遷移過來的。為了驗證這一假說，又檢測了脾臟和血液中IgM+B細胞增殖活性，如圖6J-O所示，脾臟IgM+B細胞的增殖活性顯著增加，但血液卻沒有，這進一步支持了血液中IgMlo B細胞是從脾臟中遷移過來的。
圖6
7.CoS誘導的天然IgM增強血清殺菌活性
前人研究表明，天然IgM可透過膜攻擊MAC最終殺死細菌。如圖7所示，ELISA顯示，COS誘導的天然IgM能有效地與大腸桿菌和嗜水氣單胞菌結合，特別是與嗜水氣單胞菌結合。共聚焦顯微鏡觀察表明，從COS刺激的魚血清中提取的天然IgM完全覆蓋了嗜水氣單胞菌(圖7C)，此外COS刺激的血清中細菌膜通透性也顯著增加(圖7F，G)，進一步表明COS誘導的天然IgM可通過MAC殺菌。
圖7
小 結
研究首次揭示了殼寡糖增強魚類體液免疫的細胞和分子機制，為殼寡糖在魚類養殖業中的應用提供了有力的理論支撐。此外，研究還進一步明確了魚類B細胞的先天性免疫屬性，且為研究魚類B細胞的分化提供了良好的模型。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
