2022-06-14
Environmental Science & Technology
影響因子：9.028
文章題目：Influence of Temperature on Biofilm Formation Mechanisms Using a Gravity-Driven Membrane (GDM) System: Insights from Microbial Community Structures and Metabolomics
技術手段：微生物組細菌16S rRNA基因、LC-MS非靶向代謝
派森諾與中國科學院生態環境研究中心攜手合作，于近期在《Environmental Science & Technology》上發表關于水處理系統在低溫下通量下降的內在生物學方向調控機制的相關研究成果。
研究背景
微生物普遍存在于環境當中，它們可以不斷地改變自身的生存策略以適應環境的變化。然而，我們對于微生物知之甚少。生物膜的形成被認為是微生物生存和適應各種不利的內外環境因素的普遍現象。生物膜附著在物體表面并在其上發育，其結構涉及不同種類的微生物群落，包括藻類、真菌、細菌等。生物膜的主要成分是微生物的胞外聚合物（Extracellularpolymeric substances: EPS），EPS主要由微生物分泌而成，包含不同比例的蛋白、多糖和核酸。從醫療、飲食和水質的角度來看，生物膜的形成也對人類健康構成重大威脅。
在飲用水處理工藝的過程當中，去除生物膜被全世界公認為是一項關鍵的技術問題，特別是在飲用水的處理階段和運輸階段的管道內壁上生成的生物膜。在水體凈化的膜過濾工藝中，生物膜會在短時間內形成，所以對于生物膜的清除和控制尤為重要。低壓重力驅動膜超濾技術（Ultrafiltration gravity-driven membrane: GDM-UF）是相對于傳統膜過濾技術而出現的一種節能膜系統。并且，GDM系統能夠確保生物膜的原始外觀不被高壓破壞。本研究以GDM-UF系統為研究模型，研究了兩種不同水溫條件下的生物膜結構特性及其形成機理。
技術路線
研究結果
1. 溫度對通量和膜生物污染的影響
在4 °C（LT）和25 °C（HT）的兩個溫度條件下，GDM-UF系統連續運行21天，用以評估溫度對通量和膜生物污染的影響。在前4天，觀察到高溫和低溫GDM-UF系統通量都出現了顯著下降，通量分別減少了約59.88%和78.82%(圖1a)。之后，兩種體系的通量下降速率都趨于穩定。累積通量結果顯示，兩種系統的純水通量顯著高于地表水累積通量(圖1b)。對污染膜進行沖洗可降低水力阻力，并將水通量恢復到初始水平的70 75%(圖1d)。通過計算得知，低溫下的生物膜阻力系數Rb顯著高于高溫下的生物膜的阻力系數（圖1c）。低溫處理第14天和第21天多糖含量顯著增加(圖1e);然而，HT和LT系統的蛋白質濃度沒有顯著差異(圖1d)。生物膜在低溫下的總有機碳含量（TOC）顯著高于高溫系統(圖1f)。
圖1 通量、生物膜阻力和有機碳含量隨時間的變化
2. 生物膜的表面形態
生物膜阻力的增加是導致通量下降的主要因素。通過掃描電鏡對生物膜橫截面形貌的觀察可以發現，低溫下的膜表面的生物淤積層的結構會更加致密，但在高溫下極為多孔（圖2）。我們發現高溫下微生物的代謝速率是低溫下的3倍(圖4g,h)。高溫條件下生物淤積層的結構含有明顯的多孔結構，這為水分子的通過提供了方便的途徑（圖2d-f）。與SEM觀察到的相似，AFM圖像也證實了低溫下生物膜的致密形成(圖2g-l)。致密的生物淤積層實際上由沉積的有機物與少量的微生物在嚴格避光的條件下形成的(圖1f)。有趣的是，從CLSM(圖2p-r)和SEM(圖S2)可以看出，高溫下生物膜中仍然存在藻類。藻類個體疊加可能是造成高溫下生物膜粗糙的原因。此外，CLSM圖像也證實了低溫下生物膜中多糖含量(紅色標記)較高溫下高(圖2p-r)，說明這是生物膜抗性增加的主要原因之一。
圖2 生物膜的形態特征 a-f為生物淤積層的橫截面的SEM表征， g-l為AFM 對生物淤積層表面粗糙度的表征， m-r為生物淤積層蛋白、多糖和核酸的原位表征。
3. 生物膜成分分析
如圖3所示，所有樣品都明顯含有相同的化學集團特征峰。圖3中所顯示出的大部分特征峰均為蛋白和多糖所含有的化學集團特征峰。其中1040 cm?1 (C=O)、1550 cm?1 (C-N 和 N-H)的特征峰分別代表蛋白質和多糖。而且，低溫生物膜在1040 cm?1、1550 cm?1和1645 cm?1處的峰值高于高溫生物膜(圖3b)，并且隨著低溫時間的增加而增加。此外，FTIR結果還表明，在低溫下生物膜中存在親水官能團，特別是高極性官能團酰胺基（1641 cm-1）和羧基（1040 cm-1）(圖3a,b)。較高的親水性成分更有利于細菌聚集，從而在低溫下形成致密的生物膜。通過光電子能譜檢測結果（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）還分析了兩種溫度下膜表面的化學組成（圖3c-h）。
圖3 生物膜的功能基團組成 a-b分別為LT和HT的生物膜的傅里葉變換紅外光譜圖（FTIR）。4°c和25°c下生物膜的高分辨率X射線光電子能譜圖（c,LT;f,HT）C 1s，（d,LT;g,HT）O 1s和（e,LT;h,HT）N 1s。
4.微生物多樣性分析
兩種溫度下的GDM-UF系統的表面生物淤積層在第7天、第14天和第21天的樣本的微生物群落結構能夠保持高度的一致；但兩種系統間的微生物多樣性存在著顯著差異(圖4f)。取樣原水（QH）和兩個處理（LT 和 HT）中生物淤積層的細菌OTU數量分別為593、313和988（圖4a）。顯然，低溫系統限制了微生的多種群發展，同時低溫也降低了微生物的豐富度和均勻度（圖4b-e）。豐度聚類分析結果（圖4f）表明：微生物在門和目的水平上分為兩個群落部分。
在進一步的研究中，我們利用BIOLOG平板法測定兩種溫度下生物淤積層收集的微生物對6種碳源（單糖、氨基酸、酯、醇、胺和羧酸）的利用情況。研究結果表明：25 °C條件下微生物可利用的碳源和不同種類的碳源利用速率明顯高于4 °C條件（圖4g, h），由此證實低溫條件會顯著的抑制微生物的代謝活性。
圖4 基于高通量測序技術的細菌多樣性分析
5.代謝組學分析
本研究采用非靶向代謝物檢測的方法鑒定了不同溫度下GDM-UF膜表面的生物淤積層的微生物代謝物物的差異。LT和HT組間的差異代謝物分別屬于脂類和類脂分子（11.25%）；有機酸及其衍生物（10.83%）；核苷、核苷酸和類似物（7.08%）；有機雜環化合物（6.67%）；有機氧化合物（3.33%）；苯類（2.5%），苯丙酸和聚酮（0.42%）和未定義（54.17%）（圖5b）。LT條件下比HT條件下有17種代謝物顯著下調，23種代謝物顯著上調。LT相對于與HT下調物質總量要顯著高于上調物質總量（圖5c），其中脂類和類脂分子是最顯著的下調物質（圖5a）。基于KEGG通路的代謝產物分析表明LT和HT生物膜的豐度不同，上調和下調最顯著的代謝途徑分別為嘧啶代謝和亞油酸代謝（圖5d）。
圖5 生物淤積層的代謝組學差異分析
6.代謝通路分析
研究報道稱，低溫條件下溶解氧（DO）會顯著提高生物膜的黏附能力。并且，高濃度DO會抑制亞油酸代謝。低溫條件下水中的溶解氧濃度要顯著的高于高溫條件下的溶解氧濃度（圖6）。本研究中基于微生物代謝物的差異分析表明：亞油酸代謝在低溫下被明顯受到抑制（圖5d）。本研究同時發現，低溫下亞油酸代謝中的卵磷脂、亞油酸等物質均顯著下調，其下游代謝產物二十碳三烯酸（Epoxyeicosatrienoic acids,EETs）也受到抑制。低溫高DO濃度不僅抑制EETs的積累和導致糖和以及蛋白的增多，還會導致醛基的積累，導致生物膜的黏度增加。
然而，代謝通路的改變的負面影響還不僅于此。以上代謝的變化導致了尿素循環中的L-精氨酸的前體物質咪唑丙烯酸（屬于組氨酸代謝）、脫氧胞苷、尿嘧啶等物質的含量顯著增加（圖6）。進而，L-精氨酸的含量必然增加，其下游產物尿素也會隨之增加，這顯然會對人們的日常飲水安全造成了嚴重的健康威脅。
圖6 顯著變化代謝物的代謝通路圖
7.微生物多樣性和差異代謝物聯合分析
不同代謝產物與微生物多樣性的相關性表明，Dependentiae菌門主要與亞油酸代謝有關的代謝物質存在顯著相關性（圖7a）。而Spirochaetota菌門和Acidobacteriota菌門與嘧啶代謝產物有著顯著相關性（圖7a）。斯皮爾曼相關熱圖分析表明：Deinococcus、Diaphorobacter、Emticicia等與上調的關鍵代謝物呈正相關（圖7b）；Hyphomonas、Runella、TM7a、norank_f_A4b等與上調的關鍵代謝物呈負相關（圖7b）。其中，Limnohabitans、Deinococcus、Diaphorobacter、Flavobacterium和Pseudomonas在低溫條件下均為優勢菌（圖7c），它們促進了嘧啶代謝，抑制亞油酸代謝（圖7b）。有趣的是上述優勢菌均為兼性厭氧菌。
圖7 差異代謝物與門分類級別細菌的代謝相關網絡圖
文章小結
本文通過GDM-UF模型實驗探討了低溫下濾膜表面形成的生物污染層的機理，發現低溫會增加水中的溶解氧含量。進而，在低溫和高溶解氧的作用下使微生物的嘧啶代謝途徑上調、亞油酸代謝途徑的下調。同時，低溫和高溶解氧會顯著降低微生物的代謝速率和群落結構。確定了大部分能夠在低溫、高溶解氧的GDM-UF模型中生長的優勢菌為兼性厭氧菌（Limnohabitans、Deinococcus、Diaphorobacter、Flavobacterium和Pseudomonas）。這些兼性厭氧菌在低溫代謝過程中分泌了大量的胞外多糖，將自身包裹于其中，為自身創造了一個舒適的厭氧環境。但產生的胞外多糖卻增加了生物淤積層的黏度，且多糖側鏈中的C=O和O=C-O官能團也進一步提高了生物淤積層的黏度和其對水的阻力。
本研究中部分檢測與數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
