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IF5.882！細(xì)菌基因組框架圖+比較基因組學(xué)分析助力細(xì)菌耐藥和毒力研究！

2022-02-15

期刊：《Virulence》

影響因子：5.882

派森諾與復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院的張艷梅老師課題組合作，在微生物學(xué)與免疫學(xué)領(lǐng)域的《Virulence》發(fā)表新研究成果！在本研究中，從臨床上分離得到若干個(gè)幽門(mén)螺桿菌，對(duì)這些菌株進(jìn)行高通量測(cè)序，確定了幽門(mén)螺桿菌的特定遺傳特征和與特定臨床結(jié)果相關(guān)的遺傳特異性，并確定這些基因的功能，這些數(shù)據(jù)拓寬了對(duì)幽門(mén)螺桿菌的多樣性及其與特定胃疾病關(guān)系的認(rèn)識(shí)。

研究背景

幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)感染是嚴(yán)重胃炎相關(guān)疾病的重要危險(xiǎn)因素，包括消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、胃癌。世界上有40%以上的人口長(zhǎng)期感染H.pylori，其中發(fā)達(dá)國(guó)家的比例為35%，發(fā)展中國(guó)家的比例超過(guò)50%。然而，感染患者的臨床結(jié)果差異顯著，10-15%的攜帶者發(fā)展為H.pylori相關(guān)疾病。最近的研究表明，明顯的H.pylori基因組變異導(dǎo)致了H.pylori胃定殖在不同個(gè)體中的不均勻致病性。

通過(guò)對(duì)7個(gè)保守基因(atpA、efp、mutY、ppa、trpC、ureI和yphC)的序列分析，研究了幽門(mén)螺桿菌的種群結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)目前根據(jù)地理關(guān)聯(lián)和獨(dú)特的遺傳特征分為7個(gè)種群類(lèi)型:hp- europe、hp-EastAsia、hp-Africa1、hp-Africa2、hpAsia2、hp-NEAfrica和hp-Sahul。H.pylori的不同種群結(jié)構(gòu)被認(rèn)為反映了這些分離菌的傳播途徑，這些分離菌與特定人群的歷史遷移和重新定居有關(guān)，不同的分布可能是H.pylori胃定殖臨床后果的地區(qū)差異的原因。H.pylori的致病機(jī)制復(fù)雜，其中最重要的包括特異性毒力基因、基因島和CRISPR的結(jié)構(gòu)與表達(dá)相關(guān)。在本研究中，探討了不同臨床結(jié)果的個(gè)體H.pylori的基因組特征，包括慢性淺表性胃炎(CSG)、慢性萎縮性胃炎(CAG)、消化性潰瘍(GU)和胃癌(GC)，確定了H.pylori的特定遺傳特征和與特定臨床結(jié)果相關(guān)的遺傳異質(zhì)性，并在可能的情況下確定了這些基因的功能。

研究材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：從上海胃疾病患者的胃活檢中分離得到112株幽門(mén)螺桿菌，其中慢性萎縮性胃炎（CAG）=66、慢性淺表性胃炎（CSG）=19、胃癌（GC）=1、胃潰瘍（GU）=26。

2.測(cè)序平臺(tái)： Illumina Miseq

3.分析內(nèi)容：細(xì)菌框架圖、MLST分析及MLST進(jìn)化樹(shù)、基因家族分析、基因島預(yù)測(cè)、CRISPR預(yù)測(cè)、毒力基因和耐藥基因分析等等。

研究結(jié)果

上海幽門(mén)螺桿菌的基因組特征和群體結(jié)構(gòu)分析

對(duì)112株上海H. pylori分離株進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其基因組大小在1.52-1.69Mb之間，平均GC含量為38.7%，每個(gè)基因組含有155-1624個(gè)基因；每個(gè)基因組均有36個(gè)tRNA和2個(gè)rRNA。為了進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)具有代表性，并具有足夠的廣度來(lái)代表東亞地區(qū)H.pylori的遺傳多樣性，從NCBI上找到不同地理區(qū)域的120株H.pylori與本次測(cè)序的1123株H.pylori進(jìn)行MLST分析并構(gòu)建MLST進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)92.9%的上海H.pylori分離株與亞洲的分離株聚集在一起，其覆蓋了該地區(qū)之前報(bào)道的全部變異。另外有6.3%的分離株與歐洲變異株聚集在一起，0.9%與亞洲其他地區(qū)分離株聚集在一起。

圖1：MLST進(jìn)化樹(shù)

基因家族分析

為了進(jìn)一步研究H.pylori的遺傳多樣性與臨床結(jié)果的關(guān)系，故進(jìn)行了基因家族分析。此次分析使用了112株H.pylori分離株+10株NCBI上的參考基因組，進(jìn)而確定哪些基因是核心基因，哪些基因可歸類(lèi)為臨床結(jié)果相關(guān)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些群體總共由2866個(gè)基因組成，其中有1146個(gè)基因家族（1839個(gè)基因）屬于核心基因組；209個(gè)基因?qū)儆谔赜谢颍@些基因可能和臨床結(jié)果有一定的關(guān)聯(lián)性。

圖2：基因家族分析

對(duì)這1839個(gè)基因進(jìn)行COG注釋?zhuān)Y(jié)果發(fā)現(xiàn)有1079個(gè)基因可以被注釋到，注釋到的基因與基本生命活動(dòng)相關(guān)，包括J類(lèi)（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生）、E類(lèi)（氨基酸運(yùn)輸和代謝）和M類(lèi)（細(xì)胞膜/包膜生物發(fā)生）等功能相關(guān)。對(duì)各組特有基因進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)，CSG組15個(gè)特有基因中有8個(gè)和DNA復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)；CAG組98個(gè)特有基因中有35個(gè)在COG注釋的各類(lèi)功能中里均能注釋到；GU組的17個(gè)特有基因中有3個(gè)可能與功能不明的COG相關(guān)；GC組的79個(gè)特有基因中，有59個(gè)基因能被COG注釋到，其中以無(wú)機(jī)離子和代謝為主要功能。值得注意的是，GU/GC的特有基因中也注釋到了較多的無(wú)機(jī)離子和代謝相關(guān)基因。

圖3：核心基因組COG注釋

表1：每個(gè)特有基因COG注釋

特有基因中毒力基因的分布情況

為了研究H.pylori攜帶的特有毒力基因的發(fā)生是否和臨床結(jié)果相關(guān)，通過(guò)VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析了四組中115個(gè)毒力相關(guān)基因的狀態(tài)：結(jié)果發(fā)現(xiàn)有113株菌株中檢測(cè)到了cagPAI，其中只有12株檢測(cè)到完整的cagPAI，且全部包含26個(gè)主基因，其余101個(gè)株菌僅攜帶部分cagPAI；其中CAG中攜帶完整cagPAI的菌株占66.7% (8/12)，CSG中攜帶完整cagPAI的菌株占25.0% (3/12)，GU中攜帶完整cagPAI的菌株占8.3%(1/12)。Victors數(shù)據(jù)庫(kù)還檢測(cè)到了其他20個(gè)毒力基因，其中有18個(gè)基因存在于所有122株中。對(duì)4組的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有16個(gè)毒力基因包括4個(gè)cagPAI基因和12個(gè)其他毒力相關(guān)基因是有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的；與其他所有臨床組相比，GC組這16個(gè)毒力基因的陽(yáng)性檢出率一致高于或低于其他臨床組。

表2：臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果總有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因

毒力相關(guān)基因的拷貝數(shù)情況

為了進(jìn)一步探討115個(gè)毒力相關(guān)基因拷貝數(shù)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系，我們分析了122個(gè)H.pylori中這些基因拷貝數(shù)的變異，僅在參與鞭毛蛋白修飾的基因pseB中檢測(cè)到4個(gè)拷貝。在121株和14株菌株中分別檢測(cè)到3個(gè)拷貝，其中flgG編碼鞭毛蛋白，babB/hopT編碼OMP babB作為黏附素。三個(gè)基因(fliQ、flaG和fly)在不同組的分離株中顯示出顯著不同的拷貝數(shù)。值得注意的是，GC組在這三個(gè)拷貝數(shù)方面總是顯著的，相對(duì)于其余的所有分離株，這三個(gè)拷貝數(shù)傾向于代表過(guò)多或不足。fliQ在GC組中的存在顯著低于其他各組，其拷貝數(shù)在不同組中也存在顯著差異。雖然flaG和fly的存在在不同的臨床結(jié)局組之間沒(méi)有顯著差異，但它們的平均拷貝數(shù)在GC組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的降低。因此，GC組與三個(gè)毒力相關(guān)基因拷貝數(shù)的最大離散度相關(guān)。

圖4：在四個(gè)臨床結(jié)果組中，三個(gè)毒性相關(guān)基因具有顯著不同的拷貝數(shù)

不同的臨床結(jié)局組中基因島分析

GIs有助于基因的橫向轉(zhuǎn)移和細(xì)菌進(jìn)化，因此，分析了122株H.pylori中GIs的存在情況。本次分析共識(shí)別出337個(gè)可能的GIs，它們的長(zhǎng)度從1875到71,269 bp不等。幾乎所有菌株(120/122,98.4%)均具有可能的GIs。四組患者的GI發(fā)生率均較高，但無(wú)顯著差異。最常見(jiàn)的三個(gè)GIs是HPGI-1(45.9%，56/122)、HPGI-2(12.3%，15/ 122)和HPGI-3(10.7%，13/122)。HPGI-11在15個(gè)菌株中檢測(cè)到，HPGI-12在4個(gè)，HPGI-13在1個(gè)，HPGI-14在5個(gè)，H. pylori中最常見(jiàn)的可能是GIs的基因含有更多功能未知的基因。這些基因可能編碼假定蛋白，也可能被歸類(lèi)為基因組DNA。在四個(gè)臨床結(jié)局組中，每種GI的存在沒(méi)有差異。

圖5：H.pylori菌株中最常見(jiàn)的三種假定的GIs進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析

在不同的臨床結(jié)局組中檢測(cè)到CRISPRs

鑒于H.pylori CRISPRs在胃腸道發(fā)病機(jī)制中的作用未知，本文研究了這四組菌株中CRISPRs的發(fā)生情況。GC組、GU組、CAG組、CSG組分別檢測(cè)到45.5%(5/11)、80.8%(21/26)、48.5%(32/66)和42.1%(8/ 19)的CRISPRs，四組間CRISPIR頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此次分析共檢測(cè)到79種不同類(lèi)型的直接重復(fù)序列(DR)，長(zhǎng)度為23-50 bp；其中17種DR被多次檢測(cè)到，值得注意的是，17個(gè)重復(fù)DR中有15個(gè)總是對(duì)應(yīng)于特定的間隔；有趣的是，CRISPRs在不同的分離株中要么完全相同，要么完全不同，同一分離株的CRISPRs序列不完全相同；在所有的H.pylori分離株中均未發(fā)現(xiàn)Cas基因。

圖6：H.pylori菌株中CRISPRs的分布

MLST分析

MLST將112株H.pylori分離株分為88株STs，優(yōu)勢(shì)STs為ST3274和ST3327，分別占分離株的13.4%和6.3%，不同組間ST分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，H.pylori的STs是分散的，與疾病背景無(wú)關(guān)。

研究結(jié)論

1. 人群分析顯示92.9%的上海H.pylori分離株聚集在東亞群；

2. 在所有基因組中檢測(cè)到的2866個(gè)基因，有1146個(gè)基因構(gòu)成了核心基因組，而在單個(gè)疾病組中檢測(cè)到209個(gè)獨(dú)特的基因；消化性潰瘍和胃癌組的特有基因大部分注釋到了無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能基因簇；

3. 在4個(gè)疾病組中檢測(cè)到16個(gè)毒力基因，其檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;

4. 在4個(gè)疾病組中發(fā)現(xiàn)127個(gè)CRISPR，其發(fā)生率有顯著差異;

5. 共鑒定出337個(gè)可能的基因島，其中有3個(gè)在10%以上的菌株中單獨(dú)發(fā)現(xiàn)；基因組島包括幾個(gè)代謝相關(guān)基因和許多功能未知的基因;

6. 112株上海分離的H.pylori共檢出88種序列類(lèi)型；

綜上所述，本研究在繪制特定的基因組特征和它們的功能，以確定誘發(fā)H.pylori特異性胃紊亂所需的因子研究上提供了一個(gè)重要的里程碑。

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