2022-01-23
期刊：《Applied and Environmental Microbiology》
影響因子：4.813
近日，派森諾生物與華東理工大學合作，在微生物基因組領域的《Applied and Environmental Microbiology》（影響因子4.813）發表新研究成果！在本研究中，從污水中分離得到了3種殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）噬菌體，并對其生物學行為進行了研究，其中新分離得到的噬菌體vB_AsM_ZHF對A. salmonicida亞種有抑制作用。研究結果表明，該方法可能是一種替代抗生素的方法來保護魚類免受多藥A. salmonicida亞種的感染。
研究背景
殺鮭氣單胞菌 (A. salmonicida)是一種革蘭氏陰性細菌，廣泛存在于水生環境中，可感染多種商業魚類，導致癤病和細菌性敗血癥。抗生素可預防和控制水產養殖中的殺鮭魚感染，然而，隨著細菌獲得抗生素抗性基因，抗生素的功效會下降。從大菱鲆中分離出的A. salmonicida已對多種抗生素產生耐藥性。因此，需要一些替代策略來預防和控制水產養殖中的耐多藥（MDR）細菌。
噬菌體是感染細菌的病毒，噬菌體療法已被用于控制人類、動物和植物病原體，許多成功治療MDR細菌的方法已被報道。因此，噬菌體療法有可能在臨床上用作生物抗菌劑。在本研究種，一種劇毒的A. salmonicida亞種噬菌體 vB_AsM_ZHF (ZHF) 和其他兩種噬菌體從污水中分離出來，并通過透射電子顯微鏡 (TEM) 鑒定為肌病毒科的成員，并對其進行全基因組測序和生物學特性驗證。結果發現ZHF噬菌體治療是一種潛在的水產養殖細菌性病害防治策略。
研究材料與方法
1.實驗材料：從上海某水產市場污水中分離得到的3種A. salmonicida噬菌體， vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF。
2.測序平臺： Illumina MiSeq
3.分析內容：噬菌體全基因組測序、進化樹構建、ANI分析、easyfig比較分析、耐藥和毒力基因預測、噬菌體生物學特性實驗等等。
研究結果
A. salmonicida亞種的分離和表征
從中國山東省大菱鲆皮膚潰瘍種分離得到一個白色菌落病原菌，命名為AS01。對其進行16S進化樹構建發現該菌株為 A. salmonicida，但是很難區分其亞種。通過KPI體系和vapA序列進行鑒定，確定AS01菌株為 A. salmonicida subsp. masoucida亞種。
表1 16S鑒定中使用到的菌株
三種噬菌體的分離
從上海一家水產品市場的污水中分離出噬菌體，并根據它們的噬菌斑特征選擇噬菌體進行擴增。TEM檢測噬菌體形態和大小以區分菌株，并對這3種分離株進行鑒定和命名：vB_AsM_ZHA (ZHA)、vB_AsM_ZHD (ZHD) 和 vB_AsM_ZHF (ZHF)。根據國際病毒分類委員會 (ICTV) 分類系統 (16) 的形態學特征，所有分離株都被歸入肌病毒科，尾狀病毒目。噬菌體 ZHF 在雙層瓊脂板上形成清晰的斑塊（直徑為 3.28 + 0.25 mm），具有明顯的暈圈，而 ZHA 和 ZHD 分別形成直徑為 2.02+0.47 mm 和 0.51 + 0.15 mm 的混濁斑塊。每個噬菌體都可以感染A. salmonicida，但是不能感染A. salmonicida subsp. salmonicida或其他測試物種。
圖1 A. salmonicida phage vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF 的噬菌斑和形態圖。
噬菌體的生物學特性
對這三個噬菌體的生物學特性進行研究：結果發現一步生長曲線顯示三種噬菌體的生長速率相似，噬菌體 ZHA、ZHD 和 ZHF 的上升期分別為 30、30 和 20min，破裂大小為 110、39 和 284 PFU/細胞；把噬菌體置于各種環境下繁殖以評估穩定性，結果發現每個噬菌體在 36°C 下在 6 至 8 的 pH 水平下保持活性，當PH<3并且溫度高于50°C時，噬菌體滴度急劇下降。研究發現，在 MOI 為 1 時，噬菌體 ZHA 的最高產量約為 2*109 PFU/ml。ZHD 和 ZHF 的最佳 MOI 為 0.1，噬菌體滴度達到約 3*109 PFU/ml（圖 2D）。
圖2 A. salmonicida噬菌體vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD和vB_AsM_ZHF的生物學特性。
A. salmonicida亞種的生長曲線結果表明，在0.01至100 MOI的前25h內，每個噬菌體分離物都表現出可接受的抗菌能力。在100 MOI條件下，噬菌體ZHD 感染的殺鮭魚在25h開始重新生長，而用ZHA和ZHF感染的菌株分別在40h和45h恢復生長，其中感染噬菌體ZHF的細菌在60h時恢復率最低。該菌株的爆裂尺寸最大、細菌再生時間最長、最適MOI最低，這些特征表明，ZHF對A. salmonicida subsp. masoucida的體外生長具有最好的抗菌活性。因此，噬菌體 ZHF 用于后續的實驗研究。
圖3 顯示噬菌體 (vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF) 在 MOI 為 100、10、1、0.1 和 0.01 時對A. salmonicida (AS) 生長的抗菌作用的生長曲線。
噬菌體 vB_AsM_ZHF 的基因組分析。
噬菌體ZHF基因組是一個線性DNA，由 161,887 bp 組成，GC 含量為 41.24%；ORFs 237個，占基因組的149,784 bp（92.52%），平均長度為632 bp。ORFs由40個結構和包裝蛋白基因、27個DNA復制/修飾基因、16個轉錄調控基因、14個代謝基因、3個宿主裂解基因和107個假設蛋白基因組成。毒力基因和耐藥基因分析并未發現相關基因。ZHF可能是一種毒性噬菌體，因為在基因組中未發現整合酶基因，使其成為適合噬菌體治療的噬菌體。
ANI分析結果顯示，沒有已知的噬菌體基因組與ZHF基因組表現出 100% 相同的序列同源性，這證實了它的新穎性。全基因組序列比對表明，與其他噬菌體菌株相比，噬菌體 ZHF 與氣單胞菌噬菌體相似性更高。雖然A. salmonicida噬菌體AS-gz的多個基因在基因組中的排列方式不同，但它們在 ZHF 中保留了高 ANI 值。噬菌體 phiAS4 和 AES508 以及窄食單胞菌噬菌體 IME13 的許多基因序列與ZHF相同。其他被分析的噬菌體具有與 ZHF 同源的結構蛋白，但與其他蛋白質的相似性較少。
圖4 殺鮭魚噬菌體vB_AsM_ZHF的基因組特征及比較分析。
噬菌體 vB_AsM_ZHF 對A. salmonicida subsp.masoucida的治療效果。
在大菱鲆中建立A. salmonicida subsp.masoucida的挑戰模型，每組20只大菱鲆接受 1*104、1*105或1*106 CFU/魚的i.m.挑戰。接種后 20 天 (dpi) 的存活率分別為 60%、10% 和 0%。選擇 8*104 CFU/魚作為A. salmonicida subsp.masoucida的攻擊劑量，在接下來的實驗中大菱鲆感染了該菌，通過ZHF治療發現，ZHF有可能保護大菱鲆免受A. salmonicida subsp.masoucida的侵害。
圖5 用 8 * 104 CFU/魚和噬菌體 vB_AsM_ZHF (ip) 以 8 * 102 PFU/魚 (MOI 為 0.01)、8 * 104 PFU/魚的劑量處理的大菱鲆的存活率。
在體內評估細菌負荷和噬菌體滴度，以表征ZHF對A. salmonicida subsp.masoucida的動態特性，結果發現在肝臟和脾臟中細菌負荷和噬菌體滴度的變化趨勢相似。在最初的2天，肝臟和脾臟中未檢測到細菌定植，但在接下來的幾天中逐漸增加。與 104 CFU/g 的陰性對照相比，治療組的細菌負荷上升至約 103 CFU/g。在頭腎組織中，治療組的細菌負荷在8天內保持低于陰性對照，并且穩定增長。在前2天，治療組和對照組之間的噬菌體滴度沒有差異，但治療組的噬菌體滴度比對照組下降得更慢。在肝臟和脾臟中，處理組中噬菌體滴度迅速下降8 dpi；而在對照組中，噬菌體ZHF被完全清除。與其他器官相比，頭腎組織中清除ZHF的速度更慢。綜上所述，ZHF有效地減輕了頭腎組織感染的細菌負擔，大菱鲆的免疫系統對噬菌體的清除具有延緩作用。
圖6 1、2、4 和 8 dpi 時肝臟、脾臟和腎臟中的細菌負荷（左軸）和噬菌體滴度（右軸）。
A.salmonicida subsp. masoucida 的抗炎作用。
肌肉組織病理切片顯示，A. salmonicida subsp. masoucida在8dpi時可導致炎癥細胞浸潤，噬菌體治療后可顯著減少炎癥細胞的數量進而達到對照組的水平。ZHF相對于細菌感染組1至4 dpi降低血清中白細胞介素1b（IL-1b）水平，并且在8 dpi時血清TNF-a和γ干擾素（IFN-g）水平低于對照組dpi。炎癥因子（IL-1b、IL-6、IFN-g、轉化生長因子 b [TGF-b]、腫瘤壞死因子 α [TNF-a] 和鐵調素）在 1、2、4、通過實時定量 PCR 測量肝臟、脾臟和頭腎中的 8 dpi，并通過熱圖進行可視化 。治療組的 TGF-b 水平高于感染組，尤其是在 8 dpi 時。相比之下，治療組第8天IL-1b、第1天IL-6、第2天和第4天脾臟中的IFN-g、第8天鐵調素水平低于感染組。這些結果表明，噬菌體療法有效地降低了體內炎癥水平。
圖7 體內噬菌體療法的抗炎作用
研究結論
1. 從污水中分離了一種新的A. salmonicida subsp. masoucida噬菌體ZHF，并對其生物學特性進行了鑒定；
2. 對全基因組進行測序分析，未發現抗生素耐藥性或毒力基因；
3. 噬菌體治療模型在大菱鲆體內建立和驗證了給藥方法，結果發現ZHF顯著降低了死亡率、細菌負擔和炎癥反應，且沒有明顯的副作用。
綜上所述，本研究代表了一種開發噬菌體療法來控制多重抗生素耐藥性A. salmonicida subsp. masoucida的策略。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
