2021-06-08
文章題目：Small RNA deep sequencing reveals the expressions of microRNAs in ovine mammary gland development at peaklactation and during the non-lactating period
發表期刊：Genomics
技術手段：Small RNA測序
派森諾生物與甘肅農業大學攜手合作，于近期在《Genomics》上發表了Small RNA深度測序揭示綿羊泌乳高峰期和空杯期乳腺發育中的microRNA表達相關研究成果。
研究背景
小尾寒羊是一種廣泛分布于我國北方和中部地區的高繁殖力綿羊品種，平均產羔率為280％。然而，小尾寒羊的低成活率已成為限制農民商業收益的重要因素之一。研究表明，母羊的產奶量會通過影響羔羊的發育和生長速度而影響羔羊成活率。因此，闡明小尾寒羊的乳腺發育和泌乳分子機制具有重要經濟作用。
MicroRNA（miRNA）是一類長度約20-24個核苷酸的非編碼小RNA分子。在動物中，通過與其靶基因的3'-UTR 結合而影響目標mRNA的穩定性及翻譯，最終在轉錄后水平上負調節基因表達。研究表明，miRNA是影響乳腺發育、泌乳及其與乳房相關疾病的關鍵調控因子。迄今為止，miRNA在家畜乳腺組織中表達的研究主要集中在奶牛、山羊、水牛和豬中，而在綿羊中研究很少。
因此，在本研究中，使用小RNA測序技術研究了泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織中miRNA表達譜，確定了一些差異表達miRNA及其與乳腺發育和泌乳相關的靶基因和KEGG途徑，使我們對miRNA在綿羊乳腺中的作用有了更深層次的了解。
研究方法
樣本：泌乳高峰期的小尾寒羊乳腺組織、空杯期的小尾寒羊乳腺組織
實驗方法：Small RNA測序
測序平臺：illumina Hiseq
技術路線圖見下
研究結果
1、小RNA測序數據匯總
對來自泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織的6個樣品進行小RNA測序。數據質量合格后，對數據進行小RNA序列的長度和豐度統計，結果如圖1所示：泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織中的小RNA長度分布是相似的。大多數小RNA的長度分布在18-24 nt的范圍內，其中長度為22 nt的MicroRNA（miRNA）最多，分別在泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織中占34.28％和27.00％。其次是長度為21 nt（泌乳高峰期綿羊乳腺組織中占8.44％，空杯期綿羊乳腺組織中占13.25％）和23 nt長度（泌乳高峰綿羊乳腺組織中占8.43％，空杯期綿羊乳腺組織中占9.63％）的miRNA。
圖1 小尾寒羊泌乳高峰期和空杯期乳腺組織中小RNA的長度分布及豐度
2、已知和新的miRNA的鑒定
通過與數據庫比對和預測，對小RNA進行分類注釋，注釋結果如圖2所示：以miRNA數量最多（包括已知的miRNA和新的miRNA），分別在泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織中占89.90％和88.04％。
圖2 小RNA在綿羊乳腺中的分布
（a）泌乳高峰期綿羊峰乳腺中的小RNA類型 （b）空杯期綿羊乳腺中的小RNA類型
接下來分析已知miRNAs的表達水平，空杯期的綿羊乳腺組織以miR-143，miR-21，miR-26a，miR-99a，miR-148a，let-7i，let-7g和let-7f的豐度最高（圖3）。然而，在泌乳高峰期綿羊乳腺組織中豐度最高的是miRNA是miR-148a，miR-143，miR-26a，let-7f，let-7g，miR-30a-5p，let-7a和miR-21（圖3）。
圖3 空杯期綿羊乳腺組織（a）和泌乳高峰期綿羊乳腺組織（b）中鑒定出的八個表達最高的miRNA
3、泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織間的差異表達miRNA
對已知miRNA進行差異表達分析，結果顯示（表1）：在泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織中共鑒定出23條差異表達的miRNA。相對于泌乳高峰期的綿羊乳腺組織，有八種miRNA在空杯期綿羊乳腺組織中表現出更高的表達量，其中差異表達上調最高的是miR-199a-3p，其次是miR-221、miR-125b、miR-329b-3p和miR-493-5p。相對于泌乳高峰期的綿羊乳腺組織，有15種miRNA在空杯期綿羊乳腺組織中表現出更低的表達水平。其中差異表達下調最低的是miR-148a，其次是miR-30a-5p、miR-200c、miR-200a和miR-200b。
表1泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織間的差異表達miRNA
4、差異表達miRNA的靶基因預測和KEGG通路分析
采用miRanda和TargetScan預測了差異表達miRNA的靶基因，總共鑒定出13082個靶基因。選擇差異表達miRNA中表達最顯著的十個miRNA（非泌乳期綿羊乳腺組織中上調和下調表達最顯著的miRNA各五個）以及相應的靶mRNA構建miRNA-mRNA網絡（圖4）。
圖4 差異表達miRNA的miRNA-mRNA網絡及其靶基因
注：紅色代表在空杯期中上調的miRNA，綠色箭頭代表在空杯期中下調的miRNA（相對于泌乳高峰期乳腺組織）；灰色圓圈代表預測的miRNA的靶基因
基于KEGG數據庫，對差異表達miRNA的靶基因進行KEGG富集分析。分析結果顯示：在空杯期中上調表達的差異miRNA的靶基因涉及24條代謝通路。圖5展示了富集程度最顯著的前十五條代謝途徑。其中富集程度最高的是溶酶體通路，招募了18個靶基因。其次是Wnt信號通路、 MAPK信號通路、GPI-錨定蛋白生物合成通路、內質網中的蛋白質加工通路和FoxO信號通路，分別招募了16、21、7、17和14個靶基因。
對于在空杯期中下調表達的差異miRNA，其靶基因富集于21條代謝途徑上。其中富集最顯著的途徑是PI3K-Akt信號通路 ，招募了33個靶基因。其次是內質網中的蛋白質加工通路、軸突引導通路，血小板活化通路、肌動蛋白細胞骨架調控通路和溶酶體通路，分別招募的靶基因數量為22、22、18、21和18個（圖5）。
圖5泌乳高峰期和空杯期綿羊差異表達miRNA的靶基因KEGG富集分析
（a）與高峰期相比，在空杯期綿羊乳腺組織中差異上調miRNA的靶基因KEGG富集分析
（b）與高峰期相比，在空杯期綿羊乳腺組織中差異下調miRNA的靶基因KEGG富集分析
注：x軸表示-log10（p-value），x軸表示該途徑中募集的差異表達miRNA的靶基因數目
5、RT-qPCR驗證差異表達miRNA
選擇十六個差異表達的miRNA，通過RT-qPCR驗證miRNA測序結果的可靠性。分析結果如圖6所示：miR-200b、miR-103、miR-107、miR-148a、miR-30b、miR-30d、miR-200a、let-7b、miR-30a-3p和miR-30a-5p在空杯期綿羊乳腺組織中的表達比在泌乳高峰期中低。然而，miR-125b、miR-493-5p、miR-432、miR-199a-3p、miR-221和miR-329b-3p在空杯期綿羊乳腺組織中的表達比在泌乳高峰期中高。RT-qPCR結果表明，差異表達miRNA的表達趨勢與miRNA測序結果相一致，證實了miRNA測序方法的可靠性和可重復性（結合結果3看）。
圖6 RT-qPCR驗證16個差異表達miRNA
注：數據顯示三個重復的平均值±SD；誤差棒為標準偏差
總 結
這項研究通過對泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織進行小RNA測序，研究miRNA在這兩個泌乳時期中miRNA表達情況。篩選到了一些差異表達的miRNA，及其與乳腺發育和泌乳相關的靶基因和重要的KEGG途徑(溶酶體通路、Wnt信號通路、 MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等)。使人們對miRNA在綿羊乳腺中的作用有了更進一步的了解。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
