2020-09-25
期刊：《International Journal of Biological Macromolecules》
影響因子：5.162
最近，派森諾再次與西北工業(yè)大學(xué)合作，在《International Journal of Biological Macromolecules》上發(fā)表研究論文，通過模擬消化道功能和人糞便菌群體外發(fā)酵，對沙蒿多糖的潛在益生元特性進(jìn)行了科學(xué)評估。
值得一提的是，本研究使用Illumina NovaSeq PE250模式對腸道菌群16S rRNA基因V3V4區(qū)進(jìn)行測序，并且使用了QIIME2的新分析流程（包括DADA2生成ASV、PICRUSt2功能預(yù)測分析等）。NovaSeq具有超高測序通量（點(diǎn)擊查看），研究成果當(dāng)然也容易被期刊接受啦！
研究背景
首先，什么是益生元呢？
益生元，是一類不易被人體消化、需要依靠腸道菌群降解、對宿主產(chǎn)生有益功能的食物成分，主要包括各種膳食纖維等物質(zhì)。益生元通常以低聚糖的形式存在，如低聚果糖、低聚半乳糖等就是比較常見的益生元種類啦。一般來說，它的作用主要有以下幾點(diǎn)：
1、選擇性地刺激和促進(jìn)一種或多種有益菌的生長；
2、調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)腸道蠕動；
3、增強(qiáng)胃腸道屏障等。
那么，沙嵩多糖是什么呢？沙嵩多糖是從沙嵩種子中提取的一類水溶性多糖，即ASKP。單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。另外，ASKP又可以進(jìn)一步分為兩個(gè)主要組分，比例約為1:1，一種是支鏈木聚糖（60P），單糖組成為鼠糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖；另一種是葡甘露聚糖（60S），單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖。前期研究表明，ASKP可以作為一種潛在的乳化劑，降低油/水界面張力；能減輕糖尿病db/db小鼠的高血糖和高脂血癥；可以部分逆轉(zhuǎn)腸道菌群的失調(diào)等。然而，關(guān)于ASKP的胃腸消化和發(fā)酵特性研究卻很少報(bào)道。
研究方法
實(shí)驗(yàn)方案：
1、模擬胃腸消化
2、體外發(fā)酵
3、腸道微生物群組成及其代謝分析
實(shí)驗(yàn)對象：沙蒿種子
測序技術(shù)：Illumina NovaSeq PE250高通量測序
測序模式：微生物組細(xì)菌16S rRNA基因V3V4區(qū)測序
分析手段：基于QIIME2，通過DADA2及性能序列處理，并使用PICRUSt2進(jìn)行功能預(yù)測
實(shí)驗(yàn)方案
PART 01、分子量變化、還原糖產(chǎn)生、碳水化合物消耗及pH變化
圖1 人體糞便菌群模擬胃腸消化和體外發(fā)酵過程中的多糖HPSEC色譜圖
A-C：模擬胃消化；D-F：模擬腸道消化；G-I：人體糞便微生物群體外發(fā)酵
圖1表明，HPSEC色譜圖分析顯示各多糖組分的峰在模擬胃腸道消化過程中沒有顯著變化，ASKP及其兩個(gè)組分可通過上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)而不發(fā)生顯著降解。圖1G-1I表明，在體外發(fā)酵過程中，各多糖組分的分子量均有所下降，保留時(shí)間逐漸延長，但發(fā)酵后沒有新的多糖峰產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，所有多糖組分都能被人體糞便菌群降解。
圖2 人體糞便菌群體外發(fā)酵過程中碳水化合物消耗（A）和pH（B）的變化
PART 02、體外發(fā)酵過程中SCFAs含量的測定
圖3 體外發(fā)酵24h后SCFAs終濃度和乙酸-丙酸比值的差異
首先，作為腸道菌群發(fā)酵多糖的最終產(chǎn)物——SCFAs，它在維持宿主健康方面發(fā)揮著重要的作用，如調(diào)節(jié)代謝和免疫功能。丙酸可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，增加抗菌因子的產(chǎn)生。丁酸已被廣泛認(rèn)為是大腸細(xì)胞的能量底物，具有增強(qiáng)腸上皮屏障的功能。SCFAs的含量可能是影響其功能的重要因素，如調(diào)節(jié)宿主能量獲取和代謝。
圖3表明，各多糖組分均能顯著促進(jìn)總SCFAs和特異性脂肪酸的產(chǎn)生。與FOS相比，所有多糖都表現(xiàn)出更強(qiáng)的提高丙酸產(chǎn)量和降低乙酸：丙酸比值的能力；同時(shí)，60S提高丙酸產(chǎn)量和降低乙酸：丙酸比值的能力強(qiáng)?？傮w而言，發(fā)酵過程中SCFAs組成和含量的變化基本與碳水化合物消耗和pH值的變化一致（圖2）。基于促進(jìn)SCFAs產(chǎn)生能力的不同，ASKP和60S可能比60P具有更好的調(diào)節(jié)宿主代謝的能力。
PART 03、體外發(fā)酵后腸道菌群的組成及其功能預(yù)測分析
圖4 不同分組之間腸道菌群的菌群Alpha多樣性比較
到達(dá)遠(yuǎn)端消化道的難以消化的多糖可被腸道菌群選擇性利用，引起生理變化（如pH和氧水平的改變），進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，激活有益菌群的增殖。
在評價(jià)腸道菌群多樣性時(shí)，首先采用Chao 1和Observed species指數(shù)反映物種的豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)反映群落的多樣性。如圖4所示，多糖組中Chao 1指數(shù)和Observed species均顯著低于BLK組，但顯著高于FOS組，并且ASKP和60S組均顯著高于60P組。三種多糖組的Shannon和Simpson指數(shù)相對于BLK組有所增加，60P組和60S組顯著高于ASKP組。
圖5 體外發(fā)酵后腸道微生物群的組成
為了進(jìn)一步評價(jià)腸道菌群的多樣性組成，通過PCoA分析和基于Bray-Curtis距離的聚類樹來描述不同分組菌群結(jié)構(gòu)之間的相似程度。圖5A的PCoA分析表明，根據(jù)軸1所示信息，ASKP和60P組與其他三組明顯分離；根據(jù)軸2所示的信息，60S組與BLK和FOS組分離。在圖5B中，不同的類群也被清晰地分開了，它們在聚類樹中的相似性與PCoA的結(jié)果一致。
根據(jù)門水平的細(xì)菌分類學(xué)分析，厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門是主要的分類單元。FOS和多糖組都抑制了厚壁菌門的相對豐度，其中ASKP和60P對厚壁菌門的抑制能力顯著高于60S。另外，相對于BLK組，ASKP、60P和60S顯著增加了擬桿菌門的相對豐度，而FOS顯著抑制了擬桿菌門的相對豐度。
FOS組pH值較低可能是厚壁菌門/擬桿菌門比值增加所致。ASKP表現(xiàn)出更強(qiáng)的提高擬桿菌門相對豐度的能力。相對于BLK組，F(xiàn)OS中變形菌門的相對豐度顯著升高，而ASKP和60S組則顯著降低。在門水平上，擬桿菌門是腸道中含量最高的門之一，因?yàn)樗軌驈V泛地利用復(fù)雜的碳水化合物。厚壁菌門/擬桿菌門比例的降低通常與宿主獲取能量的增加有關(guān)。此外，變形菌門普遍增多被認(rèn)為是腸道微生物失調(diào)的潛在跡象，并與糖尿病、炎癥和癌癥有關(guān)。ASKP抑制厚壁菌門的能力在很大程度上與60P有關(guān)，抑制變形菌門的能力一定程度上和60S有關(guān)。ASKP及其兩個(gè)組分在門水平上調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)，有助于預(yù)防代謝和免疫紊亂。
圖6 在ASV水平上采用LEfSe分析比較腸道菌群的差異物種
A：LDA值(log 10)大于3的直方圖；B：基于LEfSe分析的不同ASVs相對豐度熱圖；C：不同分類學(xué)水平下的相關(guān)分類學(xué)信息。
根據(jù)LEfSe分析的結(jié)果，可以看出ASKP可顯著提高ASV 78（Bacteroides）的相對豐度，60S可顯著提高ASV 1（Parabacteroides）和ASV 12（Collinsella）的相對豐度。擬桿菌屬通常具有利用多糖的能力，它與丙酸在SCFAs中的比例呈正相關(guān)。Parabacteroides屬也可以利用多糖，通過脂肪酸生物合成的代謝途徑產(chǎn)生SCFAs。Collinsella屬于放線菌，可利用多種碳水化合物，被認(rèn)為是一種有益的屬。特定細(xì)菌類群相對豐度的增加通常和參與消化降解多糖有關(guān)。因此，ASKP和60P主要被擬桿菌屬利用，而60S則主要被Parabacteroides和Collinsella利用。
圖7 碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝相關(guān)KEGG通路的熱圖
PICRUSt2菌群功能預(yù)測顯示，多糖可顯著改變菌群的代謝途徑。與60S相比，ASKP和60P對細(xì)菌、碳水化合物和氨基酸代謝的抑制能力更強(qiáng)。ASKP及其各組分對膽汁酸代謝均有顯著促進(jìn)作用。
研究結(jié)論
1、沙蒿多糖組分顯示出益生元潛力；
2、所有的組分通過胃腸道而不降解；
3、所有組分都表現(xiàn)出促進(jìn)SCFAs產(chǎn)生和降低發(fā)酵液pH值的能力；
4、所有組分都能一定程度上調(diào)節(jié)腸道菌群的組成；
5、所有組分都極大地改變了菌群功能通路。
總體而言，本研究采用測序技術(shù)和分析方法，對于菌群組成和代謝的分析是研究亮點(diǎn)，增強(qiáng)了研究的說服力。
本研究的測序和部分?jǐn)?shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。希望大家多多關(guān)注我們喲！
文章索引：Junjun Li,Bing Pang,a , Ximei Yan et al. Prebiotic properties of different polysaccharide fractions from Artemisia sphaerocephala Krasch seeds evaluated by simulated digestion and in vitro fermentation by human fecal microbiota
點(diǎn)擊閱讀原文：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813020336151
