2020-07-17
發表期刊：《Food Chemistry》
影響因子：6.306
最近，派森諾與安徽省固態發酵工程技術研究中心合作，在《Food Chemistry》再次發表論文，聯合微生物組測序、定量qPCR和代謝組檢測，全方位研究高品質釀酒酵池（老窖）與一般品質酵池（新窖）中的微生物群落結構、理化性質，從而探究釀酒品質與酵池微生物群落的關系，以擴展對釀酒酵池底部窖泥衰老過程的認識，促進窖泥的原位改善，為打造更優質的人工窖泥打下堅實基礎。
白酒，自古以來一直是我國飲食文化中的重要組成部分。傳統的白酒發酵，也是我國十分重要的工業領域。目前的研究表明，在傳統白酒的釀造過程中，微生物對白酒的品質、風味都起著至關重要的作用。
不過，以往的相關研究，主要基于窖泥的表面微生物群落，而窖泥不同深度或不同水平部位的理化性質不同，這可能會使得微生物在窖泥中呈不均勻分布。因此，我們有必要從不同維度去研究窖泥中的微生物群落結構及其相應的理化性質，從而增強對釀酒酵池窖泥衰老過程的認識，并應用于生產實踐中。
研究不同品質釀酒酵池的底部窖泥中，不同部位、不同深度下的微生物群落構成、理化因子和代謝物含量，探究影響白酒品質的具體因素。
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組16S rRNA基因V4區
實驗對象：窖泥
本研究在中國安徽省亳州市選取了6個A等（50年以上，高質量）釀酒酵池，6個C等（6年，一般品質）的釀酒酵池；，分別從不同維度采集底部窖泥：每個酒窖取4個深度（0–1 cm、1-3 cm、3-5 cm、5-7 cm），每個深度取3個部位(center、quarter和corner），共144個樣本。具體采集方式如表1與圖1所示。
采集的樣本一部分用于高通量測序，測定樣本中的原核微生物群落結構，另一部分用于測定水分、pH、氧化還原電位、NH4+-N等理化性質，并使用氣相色譜法測定乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，使用超高效液相色譜（UPLC）測定乳酸。
表1 樣本采集方式
注：A，50年以上A等窖；C，6年C等窖；n：1-6號酒窖
圖1 每個酵池的取樣示意圖
1、不同品質窖泥中的Alpha多樣性
新老窖池中各個取樣點的微生物群落多樣性如表2所示。縱向看，老窖中，0–1 cm深度樣本的Shannon多樣性指數與Chao1和OTUs豐富度指數明顯低于其它三個深度（但不顯著），而新窖中4個深度下的Shannon多樣性指數與Chao1和OTUs豐富度指數均沒有顯著差異。
橫向看，老窖中，同一深度下不同部位的各Alpha多樣性指數均沒有顯著差異；新窖中，1-3cm深度下，Center處的樣本多樣性指數均與Corner處的樣本顯著不同。而quarter處的樣本只有Shannon多樣性指數與Corner處樣本有顯著差異。
表2 新舊酵池不同取樣部位的Alpha多樣性指數
2、不同品質窖泥中的Beta多樣性
基于Weighted unifrac distances的NMDS分析結果顯示（圖2），在所有的24個采樣位點中，12個老窖和12個新窖采樣點的樣本被分為了兩個區域，這表明，老窖與新窖中的原核微生物群落結構存在明顯差異。
圖2 基于weighted unifrac distances的NMDS分析結果
顯著差異熱圖與基于Weighted unifrac distances的boxplot結果也顯示，老窖中，同一深度下不同位點的微生物群落差異較小；而新窖中，不同深度下中心取樣點的樣本（C_Cor_13，C_Cor_35和C_Cor_57），微生物群落結構均與其它樣本差異明顯，且這三個中心取樣點彼此之間差異也很大；同時C_Cen_01和C_Qua_01之間的差異也小于其它取樣點的差異。
圖3 顯著差異熱圖
圖4 基于Weighted unifrac distances的boxplot
根據以上Beta多樣性的分析結果，在后續分析中，作者將取自老窖同一深度下的3個取樣點結合在一起，組成4個具有代表性的分組：A_01、A_13、A_35和A_57；而新窖則分為5個組：C_Cen_Qua_01、C_Cor_13、C_Cor_35、C_Cor_57和C_C_Others。
3、釀酒酵池底部窖泥的菌群組成分析
從物種組成上看，新窖中的內部微生物群落差異要明顯大于老窖，且C_Cor_57樣點中的微生物群落結構與老窖更相似。在門水平上，新老酒窖中的微生物群落差異主要體現在這幾個門類：Bacteroidetes，Proteobacteria，Euryarchaeota，Synergistetes和Tenericutes；在屬水平上，各分組屬水平上的優勢微生物組成如圖2A所示。UPGMA聚類分析的結果（圖2B）顯示，A01與4個新窖中的代表性窖泥樣本更接近，而C_Cor_57則與3個老窖中的代表性樣本更接近。
在老窖中，大部分微生物類群實際上都沒有顯著差異。不過，值得注意的是，Caproiciproducens和Hydrogenispora，這兩個微生物類群，在分布模式上，呈現相反的梯度分布，Caproiciproducens在A_01樣本中有大豐度，而Hydrogenispora則在A_57中有高豐度，另外，Caproiciproducens主要存在于0-1 cm處。
圖5 底部窖泥中，九個代表性位點分組中的優勢屬構成（A）及其對應的UPGMA聚類分析（B）
4、16S rRNA基因的拷貝數定量分析
24個取樣位點的16S rRNA基因拷貝數如圖3所示，大部分取自老窖的樣本，基因拷貝數都顯著高于取自新窖的樣本（ANOVA，P < 0.05），同時，新窖樣本中的Cor_35和Cor_57與老窖樣本更接近。
圖6 24個取樣位點的16S rRNA基因拷貝數分析
5、理化性質與代謝物分析
每個代表性位點分組的理化性質和代謝物含量如表3所示。在老窖樣本中，大部分理化性質都有從表層到底層逐漸遞減的趨勢，這表明老窖中的主要理化屬性呈梯度分布。同時，與老窖相比，新窖中的Ca2+，Mg2+，丙酸，戊酸，己酸，丁酸和乙醇含量均要顯著高于老窖，而NH4+-N、總硫、K+、乙酸和PO43?在新生BPMs中均顯著降低。
表3 9組代表性窖泥位點中的理化性質與代謝物含量
6、微生物群落與理化性質、代謝物之間的關聯性
RDA冗余分析（圖7）顯示，理化性質和代謝物的分布特征，與菌群組成具有顯著相關性。其中，對微生物群落結構影響顯著的三個因子為：乳酸（35.1%）、pH（27.7%）和可溶性Ca2+（8.1%）。同時，大部分老窖樣本和新窖樣本在RDA分析中是明顯分離的，而C_Cor_35和C_Cor_57則與取自老窖表面的樣本距離較小，這表明，C_Cor_35和C_Cor_57的原核微生物群落正處于老化的過程。另外，乳酸、可溶性Ca2+、丙酸、戊酸、可溶性Mg2+、氧化還原電位、乙醇、己酸、丁酸，均與新窖中的微生物群落結構存在很強的正相關性；而pH、NH4+-N和總硫，則和老窖中的微生物群落結果有強正相關性。
圖7 底部窖泥各位點的細菌菌群、理化因子和代謝物之間的冗余分析
本文結合了微生物組16S rRNA基因測序、定量qPCR和代謝組檢測，分析了不同品質釀酒酵池的底部窖泥中，各部位微生物群落對于釀酒品質的潛在影響，并得到以下結果：
1、老窖中的菌群結構在垂直深度上有差異，但在水平位置上沒有明顯差異，這表明，多年的循環發酵在老窖中形成了固定的菌群梯度結構；
2、老窖表面0–1 cm處的微生物主要以Caproiciproducens（34.79%）為主；
3、新窖0-7 cm處的quarter部位，微生物主要以Lactobacillus（12.80%–42.72%）為主，而底部中心的微生物群落則是以Caproiciproducens（17.85%–64.45%）為主；
4、乳酸、pH與可溶性Ca2+是對窖泥微生物群落結構影響顯著的三個因子。
老窖中，0-1cm處的優勢微生物Caproiciproducens（34.79%）可作為保護性屏障，阻止乳酸菌Lactobacillus的入侵，促進酒窖深處厭氧菌的生長；新窖則在深處（尤其是3~7cm處）的中心位置開始建立Caproiciproducens屏障，而乳酸菌仍在其它位置占優勢地位。由此可知，新窖中尚未形成完整的代謝鏈以降解各種酸性物質，但其深處的中心部位也因其位點優勢，窖泥菌群正在逐漸成熟，進而形成完整的代謝鏈。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Zhang H ，Meng Y ，Wang Y ，et al. Prokaryotic Communities in Multidimensional Bottom-Pit-Mud from Old and Young Pits Used for the Production of Chinese Strong-Flavor Baijiu[J]. Food Chemistry, 2019, 312:126084.
原文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814619322332
