2019-10-31
近期，派森諾生物與華中農業大學合作再傳捷報，蔡鵬教授和吳一超副教授領銜的團隊在《Environment International》（影響因子7.943）發表重要研究論文，以土壤微生物為研究對象，結合16S rRNA基因高通量測序和多種分析手段，深入探究了土壤生物膜形成機制及其對土壤微生態的重要影響，可喜可賀！
據估計，多數微生物以生物膜的形式存在于自然環境中。越來越多的研究表明，土壤微生物主要以生物膜的形式存在，由一種或多種微生物形成的生物膜附著于多種物體如礦物表面、空隙空間、植物根系等。在生物膜形成過程中，微生物胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）被排出體外，形成生物膜基質支架，以介導表面結合并維持生物膜的黏附性。生物膜的形成可幫助微生物獲得生態優勢，如抵抗干燥環境、增加水平基因轉移機會，增加其生存能力。同時，土壤生物膜的形成也影響著土壤的理化性質，改變土壤的微環境。然而關于土壤基質中生物膜的發育過程、土壤生物膜形成的環境和生物決定因素，以及土壤生物膜對微生物代謝活性和群落結構的影響等仍有待深入研究。
1. 探究土壤生物膜形成的環境和生物決定因素；
2. 解析土壤生物膜對微生物本身代謝和群落結構的影響。
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V3V4區測序
實驗對象：土壤微生物組
實驗設計：
1. 高養分輸入誘導生物膜形成
本研究采用微孔板生物膜分析來評估養分輸入對土壤細菌生物膜形成的影響。在最低養分水平下（glucose：0.58 mM，NH4NO3：0.13 mM），生物膜形成指標OD590/OD600值最低（4.85±1.12，P<0.01），細菌懸浮液光密度最高（OD600：0.11±0.01，P < 0.01），表明在低養分水平下生物膜形成較少、游離細菌較多。單獨增加葡萄糖（5.77mM）或硝酸銨（1.25 mM）能夠促進生成生物膜（OD590/OD600：10.25±1.62或8.36±1.58），減少游離細菌（OD600：0.08±0.01或0.06±0.01）。當碳源和氮源濃度共同增加至10倍時，生物膜生成量可增加至1.3倍（P<0.01）。該實驗表明高養分條件是土壤生物膜形成的基礎。
2. 人工土壤生物膜的生長和EPS的產生
為進一步了解土壤生物膜的形成，本研究采用人工土壤對土壤生物膜進行培養。在低養分水平下，伴隨著葡萄糖的消耗，微生物生物量在前7小時增加了13%（圖1A）。10小時以后，微生物生物碳從1700減少至1600 mg/kg。在高養分水平下，微生物有著相似的生長規律（圖1B）：前10小時微生物生物碳增加至1700mg/kg；之后，盡管葡萄糖和硝酸銨還存在，微生物生物量逐漸減少。當葡萄糖耗盡時，高養分水平土壤中剩余的生物碳顯著低于低養分水平（1260±18 vs 1586±24 mg/kg，P<0.01），而生物膜EPS顯著積累。
完成整個培養周期后，通過SEM觀察土壤生物膜形成狀態。由細菌細胞和礦物顆粒組成的大量微米級團聚體在高養分水平下形成（圖2A），而在低養分水平下并沒有觀察到此類團聚體（圖2B）；通過CLSM觀察到的現象與此類似（圖2C-D）。由此表明，高養分輸入促使人工土壤生物膜的形成。
圖1 低養分（A）和高養分(B)條件下土壤微生物的生長和葡萄糖的消耗
圖2 SEM和共聚焦圖像顯示多細胞生物膜在高養分條件下（A C）發育，而在低養分條件下不發育(B D)
3. 土壤生物膜的形成增加了微生物的多樣性和均勻性
本研究通過16S rRNA基因測序來評估土壤生物膜形成過程中微生物的群落結構變化。人工土壤微生物接種后，在低養分水平和高養分水平下微生物多樣性均減小。當養分物質耗盡后，形成生物膜的土壤微生物群落的Alpha多樣性和均勻性指數顯著高于未形成生物膜的微生物群落（表1）。
Acinetobacter和Bacillus為微生物群落屬水平的優勢物種（圖3A）。在低養分水平下，Acinetobacter的相對豐度由73.7±2.8%增加至81.5±0.9%（P<0.05），而Bacillus的相對豐度維持在大約15%。在高養分水平下，Acinetobacter的相對豐度在最初的8h增加至81.4±0.9%（P<0.05），在96h后減小至74.6±0.8%（P<0.01）。在此條件下，Bacillus則表現出與Acinetobacter相反的變化趨勢：在最初的8h，Bacillus的相對豐度由15.4±1.7%減小至10.6±2.5%（P<0.05），在96h又增加至21.3±2.0%（P<0.01）。由此可見，Bacillus相對豐度的增加、Acinetobacter相對豐度的減小是形成生物膜土壤與未形成生物膜土壤的主要區別。在主成分分析（PCA）中，Paenibacillus的箭頭方向與Bacillus相近，表明Paenibacillus和Bacillus有較大的相關性（圖3B）。
表1低養分和高養分條件下培養的土壤微生物群落多樣性
圖3 優勢菌屬熱圖（A）和屬水平微生物群落結構的主成分分析（PCA），箭頭代表17個最豐富的屬，占總群落95%以上（B）
4. 土壤生物膜的形成增強了微生物的代謝活性
為評估土壤生物膜對微生物活性的影響，本研究測定了土壤中的氧氣分布（圖4A），結果表明微生物呼吸主要發生在表層土壤，有生物膜形成的土壤氧消耗量比無生物膜形成的土壤高65.4%（P<0.01）。盡管有生物膜的形成土壤微生物生物總量較于無生物膜形成更低，但前者更高的呼吸速率表明其更活躍的微生物活動并包含更多的高活性微生物。
為了解土壤生物膜對微生物代謝活性的影響，本研究在初始養分耗盡時額外添加葡萄糖和硝酸鹽以觀察有生物膜形成（前期高養分水平）和無生物膜形成（前期低養分水平）土壤中葡萄糖的消耗速率（圖4B），結果表明有生物膜形成的土壤葡萄糖消耗更快，這與其表現出更高的呼吸速率相吻合。
為更好地解釋生物膜對土壤微生物的動力學影響，本研究測定了基質誘導的呼吸反應。如圖4C所示，有生物膜的土壤微生物有著更高的基礎呼吸率（P<0.01），在基質誘導后，其呼吸速率變化更為迅速。本研究通過擬合實驗數據確定了微生物動力學參數（表2）。有生物膜的土壤顯著提高了生長耦合（Rc）和不耦合（Ru）呼吸速率，其活性微生物的比例（FAMB）以及活性微生物總量（TMB）顯著高于無生物膜形成的土壤（P<0.05）。由此表明，土壤中生物膜的形成顯著增加了活性微生物的占比，從而導致更快的養分轉換速率。
圖4土壤含氧量分布（A）; 初始養分耗盡后，土壤中添加了葡萄糖。葡萄糖的消耗表明，有生物膜的土壤對基質供應有快速反應（B）;基質誘導的土壤微生物呼吸（C）。模擬數據由實線表示具有生物膜的土壤，虛線表示帶有自由細胞的土壤。
表2 土壤微生物動力學研究
本研究發現，隨著養分供應的增加，土壤生物膜可以在人工土壤中被激發，高養分條件是生物膜形成的先決條件。雖然在高養分條件下生物量的增長較低，但胞外聚合物EPS的產量明顯增加，微團聚體得到了發展；16S rRNA基因測序分析表明，有生物膜形成的土壤微生物多樣性和均勻度指數明顯高于無生物膜形成的土壤，Bacillus 和Paenibacillus是土壤生物膜形成的關鍵物種。土壤生物膜形成后，微生物的代謝速率顯著加快。以上結果對認識土壤生物膜的形成、了解生物膜對土壤微生態的影響有重要意義。
本研究的高通量測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：Y. Wu et al. Soil biofilm formation enhances microbial community diversity and metabolic activity. Environment International 132 (2019) 105116.
