2018-12-26
研究亮點
? 證明了由更新世的冰期-間冰期氣候振蕩引起的海平面變化影響了華南大陸與鄰近島嶼之間的亞熱帶/亞熱帶生物交流；
? 嶺南青岡的分布為植物群在華南大陸島嶼上的聚集機制提供了新的見解；
? 地理隔離和環境異質性是嶺南青岡種群空間遺傳模式形成的重要因素，環境基因組學分析確定了常綠闊葉櫟樹對環境異質性的潛在適應機制。
毗鄰中國南部太平洋海岸的是許多大陸島嶼，包括最大的島嶼臺灣和海南，這兩個島嶼的物種多樣性非常相似。為了揭示華南大陸和島嶼的植物進化和生物地理歷史，研究人員選取了在分布模式和種子散布方式上具有代表性的嶺南青岡作為目標物種，利用簡化測序（RAD-seq）的方法，對其種群結構、種群歷史和進化適應性進行了研究，揭示了華南地區及其毗鄰島嶼的獨特的生物進化歷史及生物群落的局部適應性。
嶺南青岡的群體SNP檢測
RAD-seq能夠在在沒有參考基因組的情況下，從數千個同源位點生成全基因組序列數據。櫟樹等生命周期長且頻繁發生種間雜交，RAD-seq是適用于此類物種的群體進化研究的有效方法。
測序樣本采集于2010~2015年的華南和越南北部等地（表1）。對19個群體的60個植株進行RAD-seq，PstI酶切，Hiseq平臺測序（2 * 150 bp），平均數據量約為0.8G/樣。剔除數據量最低的4個樣品后，采用Stacks v1.46軟件進行分析，為了獲得最大SNP數目和最低SNP缺失率進行了參數調試，最終在2513個loci中得到5207個SNP用于后續分析。
群體遺傳多樣性和群體結構
使用Stacks v1.46軟件包中的populations模塊統計了每個群體的核苷酸多樣性（π）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho），如表1。在群體（population）水平，顯示C02群體的遺傳多樣性最高，C09和C17遺傳分化程度最高（Fst=0.258）；在群組（group）水平，HN的遺傳多樣性最高，HN和TW的遺傳分化程度最高（Fst =0.116）。
表 1：嶺南青岡的樣品信息及遺傳多樣性
采用STRUCTURE 2.3.4基于admixture model，利用非連鎖的SNP分析群體結構，利用delta-K值判斷最佳聚類值為K=3。
采用R v3.2.3軟件中的adegenet包進行PCA分析，并使用vegan包計算樣品地理坐標和PCA間的關系。PCA顯示群體分為4個類群，前三個主成分分別解釋了10.16%、6.78%和4.78%的遺傳變異。使用前兩個主成分的普氏分析顯示遺傳結構與地理分布顯著一致（p < 0.001）（圖1）。
系統發育樹的構建分別采用MrBayes v3.2.6 (MPI)和RAxML v8.2.4構建貝葉斯樹（BI tree）和最大似然樹（ML tree），模型選擇均為GTR+GAMMA model，以Quercus sichourensis 和 Q. kiukiangensis作為外群構建有根樹。貝葉斯和最大似然法的進化樹拓撲結構相似。進化樹顯示HN、SW、TW分別形成分支，但TW嵌入SE中，表明HN是其他群組的姐妹群，而SW是除HN外的其他群組的姐妹群（圖2）。
圖1：56個嶺南青岡個體的主成分分析（HN黃色，SW藍色，TW綠色，SE紅色；小圓代表個體的PCA分布，大圓代表群體的地理分布；灰色曲線代表海平面降低80m時的海岸線；箭頭表示DIYABC計算的遷移路線，箭頭粗細與有效群體大小成正比）
圖2：系統發育樹（HN黃色，SW藍色，TW綠色，SE紅色）
種群分化和種群歷史
采用DIYABC 2.1軟件的近似貝葉斯算法估計種群歷史，采用1105個SNP計算，每個SNP的缺失個體數≤3。結果顯示嶺南青岡起源于中國西南-越南北部地區，隨后散布到海南及中國東南地區。有效群體大小中間值估計為：SW : 72,000 (95% CI: 35,700–96,800)，TW : 9230 (95% CI: 2270–52,200)， HN: 65,400 (95% CI: 45,400–75,800)，SE: 93,500 (95% CI: 69,300–99,500)。 櫟屬常用的代時是50年，以此估計的分歧時間分別是：TW – SE: 227,500 年前，SE – SW: 242,000年前，HN – SW: 363,000年前。若以120年為代時，估計的分歧時間為：TW – SE: 546,000 年前，SE – SW: 580,800年前，HN – SW: 871,200年前。
環境基因組學模式
為了評估環境變量對群體遺傳結構的影響，采用R包gradientForest進行梯度森林分析（gradient forest, GF）。GF是分析空間、環境和等位基因變量之間非線性關系的有效方法。GF分析表明，24個檢測的環境因子中，等溫性（isothermality, 晝夜溫差與年溫差比值）是物種等位基因頻率最重要的預測因子，其次為年降水量、最冷季度降水量和溫度季節性（圖3, A）。在等溫性在40~42，年平均降水2000~2500 mm，最冷季度降水80~120 mm時，等位基因組成發生顯著變化（圖3, B）。
圖3：環境因子解釋遺傳變異的R2加權重要性
利用對遺傳變異貢獻最高的6個環境因子進行局部環境適應性研究。采用R包LEA進行潛在因素混合建模（latent factor mixed modeling, LFMM）分析。LFMM分析發現以下顯著關聯：48個SNP與降水的季節（bio15）性相關、30個SNP與年降水量（bio12）相關、17個SNP與溫度的季節性（bio4）相關。三類關聯SNP所屬的loci位點的Venn圖分布見圖4。
圖4：三種環境因子相關位點的Venn圖分布
總計有39個loci與環境因子相關聯，其中25個采用blastn比對到栓皮櫟（Quercus suber）的基因組（表2），注釋到的基因功能包括葉片功能調節、適應季節性降水的生殖器官發育等。
表2：受到選擇的25個候選位點
總 結
綜上所述，遺傳結構與地理分布一致，表明嶺南青岡群體有顯著的地理結構，與缺乏長距離傳播種子和缺乏群組間基因流有關。在HN群組中檢測到最高的遺傳多樣性，可能來源于SW群組。HN群組與其他3個群組表現出顯著差異，表明海南島的群體可能經歷了基因滲入，導致遺傳多樣性增加及特異性的基因庫。櫟屬種間的雜交和滲透是一種常見現象，海南島分布著多種櫟樹，這些物種可能對HN群體的高遺傳多樣性產生作用。
DIYABC推測嶺南青岡的起源地為中國西南-越南北部地區，與化石記錄一致。因此推測嶺南青岡在中國西南有很長的進化歷史并至少在新第三紀晚期就廣布于西南地區。近期對中國東南植物群落的研究同樣表明，中國西南部是東南地區植物的發源地。
海南島與大陸有相似的植物群落組成，兩者的差異隨著海島形成導致的地理隔離而產生。本研究推測嶺南青岡傳播到海南和臺灣的時間晚于海島與大陸分離的時間。此外，海南的植物群落與亞洲熱帶物種有很強的相似性，而特異性很低，表明是大陸起源的。晚更新世的冰川期和間冰期伴隨著海平面的升降，對海陸變遷有深遠影響。嶺南青岡傳播到海南和臺灣的時間與冰川期一致，而分布到東南的時間與冰期后時間一致（圖5）。冰川期的海平面比現在低64~85m，有大陸橋連接著海南、臺灣和華南大陸。因此推測冰川期的大陸橋使嶺南青岡分布至島嶼，并使得大陸和島嶼間生物交流成為可能。
圖 5：華南地區海平面高度變化圖（紅色和粉色標記分別代表以50年和120年為代時計算的遷移時間；方形：遷移到海南，星形：遷移到東南，圓形：遷移到臺灣）
除了地理隔離，環境因子的變化同樣影響嶺南青岡的遺傳結構。結果顯示，等溫性與群體遺傳變異關系作為顯著。LFMM分析表明降水季節性對嶺南青岡的局部適應性貢獻作為顯著。葉片的性狀和功能，如葉形、大小和比葉面積，受到遺傳和環境因子的強烈影響。野外調查顯示葉片性狀隨水分供應而變化，具有厚革質葉且邊緣后卷的個體常生長于開放多風且有季節性干燥期的地帶（圖1(C), type I），而具有薄革質葉且邊緣平整或輕微后卷的個體生長于全年高濕度的地區（圖1(C), type II）。本研究檢測到的與葉片性狀相關的適應性位點包括絲氨酸-乙醛酸鹽轉氨酶基因、MADS-box基因、微管折疊輔助因子D基因等。結果表明嶺南青岡通過調節營養器官和生殖器官來響應氣候變化。
參考文獻
Jiang, Xiao-Long & M. Gardner, Elliot & Meng, Hong-Hu & Deng, Min & Xu, Gang-Biao. (2019). Land bridges in the Pleistocene contributed to flora assembly on the continental islands of South China: Insights from the evolutionary history of Quercus championii. Molecular Phylogenetics and Evolution. 132. 36-45. 10.1016/j.ympev.2018.11.021.
