2018-11-23
最近，派森諾生物再次與東華大學合作，在期刊《Water Research》（影響因子7.051）上發表文章，揭示如何提高利用有機廢物生產高炫光性的L-乳酸的生物轉化效率。
研究背景
為了緩解化石燃料危機和有機廢物污染，通過生物降解有機廢物來得到高附加值的乳酸已經引起了廣泛關注。乳酸常常應用于食品工業，醫療，動物飼養和化學工業，特別是高炫光性（OA）的L-乳酸或者D-乳酸，有著更高的使用價值。而化學合成的乳酸只能生成外消旋混合物，微生物發酵可以產生高OA乳酸異構體。
近來發現電子發酵（EF）可以作為一種新型的生物電子化學系統，通過電極控制微生物發酵。但是目前對于從有機廢物中轉化為高OA乳酸的產生過程，即利用混合培養生物技術作為陰極電子發酵（CEF）這一過程還知之甚少。
本研究的目的是通過CEF系統提高具有高OA的L-乳酸的高產率，闡述乳酸生產過程中每一步的代謝途徑。同時，討論丙酮酸轉化為乳酸的關鍵步驟和異構化反應，最后通過開放通路運行試驗研究微生物菌群的結構變化和電子供體對乳酸生產的響應。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq平臺
測序模式：細菌16S rRNA基因V3-V4區
實驗設計：
廢物處理廠的第二沉淀池中收集廢活性淤泥，食物殘渣收集自東華大學校內餐廳，并研磨成泥漿狀，泥漿食物殘渣用自來水稀釋，再和廢活性淤泥混合，稀釋到一定程度作為發酵底物。
發酵實驗批次 | 組名 | pH | 溫度 | 電壓 | 電極 |
A | T25 | NC | 25±1 | -300±5 | Cathode R-NV |
BT25 | / | / | |||
T35 | 35±1 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BT35 | / | / | |||
T50 | 50±1 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BT50 | / | / | |||
B | pHNC | NC | 50±1 | -300±5 | Cathode R-NV |
BpNC | / | / | |||
pH7 | 7±0.05 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BH7 | / | / | |||
pH9 | 9±0.05 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BH9 | / | / | |||
pH11 | 11±0.05 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BH11 | / | / | |||
C | Blank | 7±0.05 | 50±1 | / | / |
V+800 | +800±5 | Anode R-PV | |||
V+600 | +600±5 | ||||
V+400 | +400±5 | ||||
V-0 | 0±5 | Cathode R-NV | |||
V-100 | -100±5 | ||||
V-300 | -300±5 | ||||
V-500 | -500±5 |
圖1 CEF系統原理圖
3 研究結果
3.1 優化陰極法乳酸生產的發酵參數
圖2闡述了陰極法產生乳酸的最佳溫度和pH值，發現陰極法產生乳酸的最優發酵參數是pH值為7，溫度是50℃。
圖2 陰極法轉化乳酸發酵溫度和pH最優化選擇
3.2 不同外加電壓對乳酸產量的影響
圖3A中可以看到施加不同外部電壓情況下乳酸的產量，相比沒有施加電壓的Blank組，發現在V+800，V+600，V-0，V-100和 V-300條件下乳酸產出增加，特別是V-100組的乳酸表現出最高的OA。圖3B表明V-0，V-100，V-300和V-500條件下乳酸的產出顯著高于Blank。在圖3C中解析了乳酸產生的時間進程，發現V-100組達到最大濃度的時間相對于Blank組縮短了一倍的時間，說明高OA總乳酸的產生最優電壓是-100mV。
圖3 不同電壓條件下乳酸的產出量
3.3 乳酸產生的代謝途徑
實際上，有機廢物發酵成乳酸需要經過幾個微生物代謝步驟，包括增溶、水解和酸化階段。在增溶階段，VSS和SCOD都沒有表現出顯著差異，所有試驗結果都幾乎在同一水平。在水解階段，發現可溶性碳水化合物含量很快達到最高水平，隨后也快速減少，結果表明施加電壓并沒有帶來顯著影響。在糖酵解階段，單糖轉化為重要的中間代謝物丙酮酸，從分析數據中發現丙酮酸在Blank組比R-NVs組中要高77.6%。在酸化階段，丙酮酸轉化為乳酸和VFA，在結果中VFA的濃度和組成在R-NVs和Blank中沒有顯著差異。結果說明采用陰極法進行發酵可能還是會影響到丙酮酸轉化為乳酸的代謝過程。
圖4 CEF系統中有機廢物轉化為乳酸的代謝過程
3.4 電子供給催化乳酸生成與異構化反應
CEF系統可以增強丙酮酸轉化為乳酸，但是也需要進一步說明負電壓對丙酮酸轉化為L-乳酸還是D-乳酸的影響。圖5A說明在不受原生有機廢物基質的干擾條件下，模擬分批發酵試驗是可以接受的。18h時，D-乳酸在Test-P和Ctrl-P組中是相似的，而L-乳酸在Test-P中是要比Ctrl-P中要高77.9%，說明在還原反應環境中丙酮酸更容易被轉換為L-乳酸。
同時，異構化途徑可以將D-乳酸和L-乳酸進行相互轉化。圖5B和C說明陰極法可能影響不了乳酸異構體化的反應，因為在結果中并沒有發現D-乳酸和L-乳酸的增加。
圖5 電子供給對丙酮酸轉化為乳酸和異構化反應的影響
3.5外加電壓作用下微生物群落的變化
電子加入到CEF系統產生了還原生態位，可能導致群落遷移和細菌豐度的變化。Chao1和ACE結果說明V-500組中細菌豐富度最高，但是V-300組中細菌多樣性最高。通過圖6可以比較門綱目科屬的微生物物種組成變化，發現在門綱目水平上，R-NVs和Blank表現出相似的物種組成結果。而在科和屬水平發現微生物菌群發生了變化，例如在Blank組中主要屬物種是和乳酸產生相關的，分別是Caldicoprobacter和Clostridium，而其他各組中屬水平的差異物種也都是與乳酸的產生有關，分別是V-0（Enterococcus和Caldicoprobacter），V-100（Caldicoprobacter和Lactobacillus），V-300（Caldicoprobacter和Clostridium）和V-500（Sporanaerobacter和Tepidimicrobium）。
圖6 Blank，V-0，V-100，V-300和V-500組細菌菌群的組成
3.6 CEF系統短期進行乳酸生產的開放通路運行試驗
通過研究結果推測微生物是通過陰極法直接接受電子供應，這可能影響了細胞代謝中乳酸產生的氧化還原對的穩態。圖7結果表明不同時間進程發酵產出結果是相似的。但是24h后取消R-O開放通路試驗中陰極的刺激，乳酸積累停在8.85g/L，96h后開始減少。相反，在48h時R-C中L-乳酸濃度提高到20.42g/L，72h時D-乳酸達到9.57g/L。說明陰極法為電子供給提供了保證提高乳酸生產量的機會。
圖7 短期CEF開放通路試驗對乳酸生產的影響
4 總結
利用CEF系統，顯著提高了有機廢物轉化為乳酸的產量，也改善了L-乳酸的炫光性。電子供給促進了丙酮酸轉化為乳酸，特別是L-乳酸。也發現影響到了科和屬水平微生物菌群的變化，CEF系統中的陰極有利于電子供給保障有機廢物轉化為乳酸的快效率。
研究亮點
1、 在-100mV電壓下，陰極法產出乳酸的產量提高了4.73倍。
2、 CEF系統中炫光性L-乳酸含量相比對照組中的3.6%增加到了42.3%。
3、 采用-100mV的電壓條件下，丙酮酸轉換為L-乳酸的效率提高了77.9%。
4、 科和屬水平微生物菌群在CEF系統中發生變化。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
參考文獻
Xue G , Lai S , Li X , et al. Efficient bioconversion of organic wastes to high optical activity of l-lactic acid stimulated by cathode in mixed microbial consortium[J]. Water Research, 2017, 131:1-10.
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.12.024
