2021-01-25
在微生物研究領(lǐng)域，傳統(tǒng)的下一代測序技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的突破，極大地促進(jìn)了我們對人體微生物組的分類、功能及其宿主影響的理解，但在揭示微生物群落復(fù)雜性和功能多樣性方面仍存在一些限制。而微生物單細(xì)胞測序技術(shù)的問世，正為我們帶來了一種全新的解決方案。與傳統(tǒng)的NGS測序相比，微生物單細(xì)胞測序技術(shù)可以突破細(xì)胞混合效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對微生物群落中每個個體細(xì)胞的獨(dú)立測序和分析，從單個細(xì)胞的層面了解微生物菌落的異質(zhì)性(不同形態(tài)特征、生化特性和基因表達(dá)譜等)、微生物群落中不同細(xì)胞的功能、互作關(guān)系和遺傳變異。
上海派森諾2023年正式發(fā)布了微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)服務(wù)產(chǎn)品—smRNAPSN-seq，基于10X 微流控平臺的微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了微生物單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組分析，它將促進(jìn)未來在鑒定新的細(xì)胞亞群、微生物表型異質(zhì)性的分子機(jī)制(耐藥性、刺激環(huán)境適應(yīng)性、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量差異等)、微生物演化及微生物與宿主相互作用等領(lǐng)域的研究。有關(guān)微生物單細(xì)胞測序技術(shù)的整體實(shí)驗(yàn)流程、實(shí)驗(yàn)質(zhì)控、rRNA去除以及送樣攻略前面已經(jīng)介紹完了，現(xiàn)在讓我們來介紹一下微生物單細(xì)胞測序技術(shù)的數(shù)據(jù)分析流程、實(shí)測數(shù)據(jù)結(jié)果以及主要應(yīng)用方向。
數(shù)據(jù)分析流程 微生物單細(xì)胞測序技術(shù)主要的分析流程(如圖1所示)。首先需要對微生物單細(xì)胞文庫的原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本分析，依次為數(shù)據(jù)質(zhì)控、參考基因組比對、Barcode和UMI的校正與計(jì)數(shù)以及根據(jù)Barcode和UMI的統(tǒng)計(jì)結(jié)果生成Feature-Barcode表達(dá)矩陣。然后根據(jù)單細(xì)胞基因表達(dá)矩陣和每個細(xì)胞的表達(dá)譜特征去除低質(zhì)量的細(xì)胞。使用相關(guān)軟件識別與解釋單細(xì)胞原始的表達(dá)矩陣中異質(zhì)性的來源，該步驟主要包括細(xì)胞與基因的質(zhì)量控制，降維與細(xì)胞聚類，標(biāo)記基因可視化與差異分析等。在完成標(biāo)記基因鑒定和差異分析后對基因集進(jìn)行通路分析(GO和KEGG)以及使用Monocle軟件根據(jù)單細(xì)胞基因表達(dá)的相似性進(jìn)行擬時序分析來說明細(xì)胞類群之間的關(guān)系。 圖1 smRNAPSN-seq數(shù)據(jù)分析流程
實(shí)測數(shù)據(jù)結(jié)果 為驗(yàn)證smRNAPSN-seq實(shí)驗(yàn)技術(shù)和數(shù)據(jù)分析流程的可行性，我們進(jìn)行了內(nèi)測實(shí)驗(yàn)，部分?jǐn)?shù)據(jù)分析結(jié)果如圖2所示，UMAP分析顯示出17個細(xì)胞亞群，其次每個亞群間的高表達(dá)基因和基因表達(dá)量也出現(xiàn)明顯差異(圖2a、b、c)。同時確定每個亞群的差異表達(dá)基因并進(jìn)行了熱圖分析(圖2d)。此外，樣本間的數(shù)據(jù)分析顯示：空白組與處理組的細(xì)胞亞群比例和部分功能基因表達(dá)量存在顯著差異(圖2e、f)。以上結(jié)果表明細(xì)菌在處理的條件下會出現(xiàn)異質(zhì)性，而傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序會掩蓋這種異質(zhì)性的存在，而smRNAPSN-seq可以發(fā)現(xiàn)并區(qū)分這種異質(zhì)性。 圖2 smRNAPSN-seq實(shí)測數(shù)據(jù)結(jié)果展示
主要應(yīng)用方向 本公司采用smRNAPSN-seq實(shí)驗(yàn)方法分析了在實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件下微生物菌群的異質(zhì)性，大大增加了發(fā)現(xiàn)稀有罕見細(xì)胞亞群的概率，同時可以根據(jù)細(xì)胞亞群間的差異和高表達(dá)基因進(jìn)行基因選擇敲除，以此在單個細(xì)胞的層次來探究細(xì)胞代謝調(diào)控等通路的分子機(jī)制。此外微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序還可應(yīng)用于以下研究：(1)抗生素耐藥分析：無需進(jìn)行分離培養(yǎng)，從單個細(xì)胞層次的基因表達(dá)情況研究細(xì)菌的耐藥機(jī)制；(2)微生物時序表達(dá)分析：鑒定外在特殊狀態(tài)的細(xì)胞并確定它們分化發(fā)育過程，結(jié)合基因表達(dá)變化，實(shí)現(xiàn)單個細(xì)菌內(nèi)表達(dá)量的檢測來解析微生物時序表達(dá)；(3)微生物群落功能定位分析：可以在研究單個細(xì)菌基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，將每個細(xì)菌(物種)與其基因表達(dá)信息相關(guān)聯(lián)，有助于了解微生物群落內(nèi)的異質(zhì)性，生態(tài)進(jìn)化壓力和進(jìn)化過程等，如圖3所示。 圖3 微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用方向 在微生物學(xué)研究領(lǐng)域，微生物單細(xì)胞測序技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)成為了不可或缺的工具。然而，這項(xiàng)技術(shù)對數(shù)據(jù)處理和分析能力的要求也在不斷提高著。作為一家國內(nèi)知名的科技服務(wù)公司，我們一直致力于開發(fā)最先進(jìn)的工具和流程，以幫助研究人員更好地理解微生物世界的復(fù)雜性和多樣性。我們的微生物單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析流程，不僅可以提供高效、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)處理和分析結(jié)果，還可以為您提供個性化的解讀和建議，幫助您深入探索微生物群落中的生物學(xué)信息。感謝您的耐心閱讀，我們期待為您的研究提供更優(yōu)質(zhì)、更全面的支持。
