2017-05-17
目前，轉錄組測序（RNA-seq）是檢測生物體內全部基因表達變化的通用方法，RNA-seq有三大優勢：無需知道實驗樣本的基因組序列；RNA-seq結果中包含比傳統定量更多的信息；RNA-seq覆蓋的范圍更廣，更精確。RNA-seq已經在基礎醫學、臨床研究和生命科學研究領域得到廣泛應用，但是有一個問題一直困擾著研究人員，那就是RNA-seq與RT-PCR結果不能完全對應，是什么原因導致的呢？這些對應不上的基因有什么共同特點？
2017年5月，來自比利時根特大學的Celine系統的闡述了RNA-seq中non-concordant序列的存在情況及其特點，結果發表在Scientific reports上。研究者以MAQC-1人通用和大腦RNA為樣本，使用RT-PCR對RNA-seq數據進行驗證，通過對18080個蛋白編碼基因的分析，發現non-concordant在不同的RNA-seq分析方法中均存在，RNA-seq和RT-PCR的相關性超過80%，但是約15.1%-19.4%的RNA-seq結果與RT-PCR對應不上，non-concordant序列中有1.6%-2.8%與RT-PCR結果完全相反。non-concordant序列的共同的特點是序列較短和外顯子少，但與GC含量和同源基因的多少沒有關系。造成這些序列non-concordant的原因有很多，包括原始數據的過濾、接頭引物的選擇和分析方法等有關。
本研究證實了RNA-seq中non-concordant的普遍存在并闡明了這些序列的特點。因此我們在分析轉錄組數據時不能不假思索的全盤接受或只看表達量的變化，也要關注序列的長度、組成和檢測質量等信息。如果RNA-seq結果與RT-PCR結果不相符，那么我們可以分析序列的長度、功能和外顯子的組成等信息，而不是直接否定轉錄組的數據，如果部分目標序列的表達量低或者序列較短，那么我們可以使用RT-PCR進行多次驗證，并通過其它實驗進行驗證。
總之，轉錄組的解析是一個系統工作，需要RNA-seq數據分析、RT-PCR以及其它輔助實驗的緊密結合，這樣才能使我們的數據更加準確和具有說服力。
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原始文獻：
Everaert C, Luypaert M, Maag J L V, et al. Benchmarking of RNA-sequencing analysis workflows using whole-transcriptome RT-qPCR expression data[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 1559.
相關文獻：
1. Christelle R, Watson M. Errors in RNA-Seq quantification affect genes of relevance to human disease[J]. Genome Biology, 2015, 16.
2. Teng M, Love M I, Davis C A, et al. A benchmark for RNA-seq quantification pipelines[J]. Genome biology, 2016, 17(1): 74.
