2022-09-22
單細胞轉錄組技術作為目前科研領域的一大熱門，可以以高分辨率對數百萬個單細胞的轉錄信息進行分析，研究單個細胞的特性和功能的多樣性、細胞間的異質性等問題，使我們能更深入地了解復雜的生物系統。今天我們就對近期發表的《Cell Stem Cell》文章進行解析，看單細胞數據如何揭示肝臟的再生過程。
研究背景
肝臟是一個高度異質的器官，具有代謝、解毒、造血、分泌膽汁等功能。肝臟由無數大小、形態相似的肝小葉（Liver lobule）組成，其中門靜脈（PV）位于鄰近肝小葉間的連接處，富含營養的血液經門靜脈由腸道進入肝臟，而耗盡養分及氧氣的血液則經中央靜脈（CV）排出。正常情況下，肝臟通過其組織內的成千上萬的肝小葉完成其復雜的功能。血液首先進入小葉的角落，稱為“門脈節點”，并通過竇性通道流入引流的中央靜脈 (CV)。這種極化的血流與肝細胞的連續消耗和分泌相結合，產生氧氣、營養物質和激素的梯度分布，導致高度異質的微環境，因此肝臟中不同位置的細胞在基因表達上呈現顯著差異，約一半的肝細胞基因是呈帶狀分布的，例如糖異生和蛋白質分泌等過程是由門靜脈周圍肝細胞負責，其他過程如藥物解毒則由中心周圍肝細胞發揮功能，該現象稱為“肝臟分區”，目前尚不清楚這種空間異質性如何影響肝臟病理和再生過程。 此外，肝臟也是再生能力最強的器官之一。在急性劑量的藥物作用下，試圖解毒這些外來物質的中心周圍肝細胞被有毒中間體淹沒而死亡。剩下的肝組織進入再生模式，導致受損的小葉層迅速愈合和替換。分區再生涉及一系列相互協調的過程，對反應有嚴格的時空控制要求。死亡的肝細胞需要被有效清除，防止多種新抗原暴露以誘導適應性免疫系統。細胞外基質需要被快速構建以支持組織支架，但一旦新細胞形成就要分解，以防止持久的纖維化。最重要的是，起源于小葉區表達特征截然不同的肝細胞需要快速生成和重新編程，以接管中心周圍肝細胞的關鍵功能。目前，在整個分區再生過程中，肝臟組織各細胞類型的協調反應的時空動力學仍亟待探索。 本文利用單細胞轉錄組、轉錄組聯合空間轉錄組測序技術解析急性損傷后肝臟不同區域再生的時空程序性調控過程，發現肝細胞在小葉內增殖以迅速產生缺失的細胞，新進的中心周圍肝細胞在分區內重新編程，改變形態，提高蛋白質周轉并上調癌胚基因。非實質細胞通過區域相關的因素對該過程進行協調。本研究的開展促進了人類對于肝再生過程的區域性協調程序的理解。
研究思路
研究結果
一、肝臟組織再生的細胞圖譜 本研究在小鼠體內注射乙酰氨基酚（APAP，急性肝臟損傷誘導劑）后以引發小鼠肝臟損傷模型，并在多個時間點對肝臟進行采樣，通過RNA測序（bulk RNA-seq）、單細胞RNA測序（scRNA-seq）、Visium空間轉錄組學分析以揭示肝臟組織再生的分子機制（圖1A）。bulk轉錄組分析了不同時間點的生物學通路變化、并且利用單細胞數據解卷積bulk數據分析細胞比例的變化，空間轉錄組分析細胞的位置變化與空間基因特征。通過注射APAP后不同時間點的肝小葉成像發現，大量的中心周圍壞死在48小時后達到峰值。損傷的中心周圍區域在72小時后出現收縮，出現新的中心周圍肝細胞，在96h后完全取代壞死組織（圖1B）。 bulk RNA-seq數據的通路分析顯示，早期免疫信號的誘導，在APAP后6和24小時達到峰值，增殖通路在APAP后48 h達到高峰。肝臟代謝功能，如谷胱甘肽和細胞色素P450代謝，以及靜止的造血干細胞功能，在APAP后72 h重新出現（圖S1C）。 本研究從6個時間點（control、24h、48h、72h、96h和1w）的28只小鼠的肝臟中共獲得 23944個單細胞，注釋為11種細胞類型（包括肝細胞、內皮細胞，肝星狀細胞，Kupffer細胞，單核細胞，巨噬細胞等）(圖1C1D)，利用單細胞數據解卷積bulk數據量化肝臟損傷再生過程中細胞組成比例的動態變化，發現在APAP注射48小時后肝細胞數量顯著降低、細胞壞死達到峰值，然而注射96小時后可逆轉到正常水平。相反，肝星狀細胞，單核細胞和巨噬細胞的數量隨著損傷逐漸增加，到注射24-48小時后達到峰值，隨后又慢慢恢復到正常水平（圖S1D）。Kupffer細胞和內皮細胞在48小時時增殖達到高峰，但并沒有出現細胞豐度的增加，提示可能除了肝細胞外，一些Kupffer細胞和內皮細胞在急性損傷期間死亡，并通過增殖來維持數量（圖S1E），該分析顯示出肝臟基因表達和多種肝細胞類型比例的重大變化，在損傷后4天就迅速恢復到控制水平。 Figure 1. 肝臟組織再生的細胞圖譜 Figure S1. 肝臟組織再生過程中的時間動態變化 二、肝細胞再生過程中區域性重編程和跨肝小葉的廣泛增殖 中心周圍和門靜脈周圍肝細胞在未受干擾的肝臟中表現出明顯不同的基因表達模式，Bulk RNA-seq數據分析表明，肝細胞特異性基因的轉錄在早期時間點偏離對照，但在注射APAP后96小時恢復到對照水平（圖2A）。單細胞數據中包括來自對照、APAP 注射后 48 和 72 小時的 2,770 個肝細胞（圖2B）。通過進一步深入分析損傷后肝細胞的轉錄組和空間轉錄組數據（圖S2H），獲得了肝細胞再生過程肝小葉帶狀分布的不同空間位置的坐標基因，從而將沿肝小葉軸空間分成三個帶狀區域：中心周圍區（pericentral）、小葉中區（midlobular）和門靜脈周圍區（periportal zones），并重建了肝細胞再生過程的基因空間帶狀表達圖譜。正如預期一樣，中心周圍肝細胞在48小時被耗盡。在72小時，帶狀坐標的分布接近損傷前的模式（圖2C2D2E2F）。進一步利用單分子熒光原位雜交（smFISH）驗證了該肝細胞再生帶狀圖譜的帶狀基因，如中心區的Glul和Cyp2e1以及門靜脈周的Ass1，在損傷再生過程存在明顯的帶狀模式（圖2G2H）。 為了研究呈帶狀分布的不同肝細胞亞群對于損傷再生的增值響應能力是否有差異，使用smFISH定量檢測增殖標記物Mki67在其中不同肝細胞中的比例：在整個再生過程中，距離受損組織區域很遠的小葉中部和門靜脈區的肝細胞呈Mki67陽性（圖2I2J）。不同小葉區增殖和非增殖肝細胞之間的差異表達分析表明，增殖肝細胞中的肝細胞代謝功能降低。肝細胞在整個小葉軸的廣泛增殖可能有助于產生有絲分裂壓力，從而快速替換受損區域的細胞，這種有絲分裂壓力將小葉中部肝細胞帶入中心周圍區，需要對其轉錄狀態進行重編程。 Figure 2. 重建肝細胞再生過程基因空間帶狀表達圖譜 Figure S2. 空間轉錄組數據集分析 三、界面肝細胞基因表達模式及形態特征 為了進一步研究有絲分裂壓力如何將小葉中肝細胞通過重編程帶入中心區，本研究繼續對注射APAP后48h和72h的中心周圍肝細胞及對應區域的對照組肝細胞的轉錄本做差異分析，這些肝細胞存在于損傷與未損傷界面處，因此命名為“界面肝細胞”，發現這些細胞具有明顯的基因表達特征，包括胚胎期肝臟和肝細胞癌中高表達但在成人肝細胞中不表達的基因，例如Afp（編碼胎兒血清蛋白的甲胎蛋白），Spp1（編碼骨橋蛋白），Cdh17（肝細胞癌中編碼與Wnt信號激活相關的鈣粘素蛋白）（圖3A3B），并使用smFISH來驗證這些基因的特異性表達（圖3C3D）。通過GSEA分析發現界面肝細胞上調包括核糖體和蛋白酶體在內的通路（圖3E）。此外還發現界面肝細胞呈間充質樣形狀，細長的突起延伸到損傷區，與非界面肝細胞相比，圓形度較低（圖3F3G）。這些結果表明，界面肝細胞不會簡單地從門靜脈周圍/小葉中狀態轉變為中央周圍狀態，因為它們被推入中央周圍區域。相反，其細胞特性的變化與胚胎期基因的瞬時表達、蛋白質翻譯和降解的升高以及細胞形態的改變有關。 Figure 3.界面肝細胞基因表達模式及形態特征 四、肝星狀細胞（HSC）的空間分工模式 完善的組織再生往往需要組織內部細胞間的高度協作。肝星狀細胞（HSC）在肝臟損傷再生過程中也起非常關鍵的作用。本研究聯合前人已發表的單細胞數據集進一步重建了HSC沿肝小葉軸的空間帶狀分布模式（圖4A），發現HSC具有明顯的空間分工模式：中心周圍區（pericentral）、小葉中區（midlobular）和門靜脈周圍區（periportal zones）(圖4B)。通過與空間轉錄組數據集比較，驗證了HSC基因的時空動力學（圖S2I）。肝星狀細胞靜止基因如視黃醇結合蛋白（Rbp1）和卵磷脂視黃醇酰基轉移酶（Lrat）的表達水平在所有區域都下降，并在96小時后恢復到對照水平（圖4C）。相反，參與肝星狀細胞激活的基因，如平滑肌肌動蛋白基因（Acta2），在20h達到表達高峰，主要在中央周圍區的肝星狀細胞中表達（圖4D）。在APAP誘導的損傷和再生過程中，細胞外基質基因的表達在48h以空間依賴的方式發生了實質性的變化，最顯著的是在中心周圍的HSCs，與受損區域所需的基質積聚行為相一致（圖4E）。肝星狀細胞增殖基因在48h達到高峰，且門靜脈周圍區和小葉中區比中央周圍區有更高的表達（圖4F）。綜上，可以推出中央周圍的HSC快速響應APAP誘導的損傷，激活并產生ECM，并與免疫細胞相互作用，而門靜脈周圍的HSC優先增殖，生成可遷移到受損區以支持主動再生過程的備用HSC。大多數HSC激活配體起源于單核細胞和巨噬細胞、內皮細胞和HSC本身。本研究發現了區域特異性HSC表達模式，這些模式可能促進急性APAP損傷后肝臟表現出的免疫招募、ECM積聚和分解的時間協調過程。 Figure 4. 肝星狀細胞的空間分工模式 五、肝臟內皮細胞在再生過程中出現帶狀分布特征 肝臟內皮細胞是肝功能的重要調節細胞，主要功能是清除內毒素、細菌和其他化合物，調節宿主對病原體的免疫反應以及呈遞抗原等。研究表明，與肝細胞和肝星狀細胞相似，肝臟內皮細胞同樣表現出沿著肝小葉軸呈現帶狀分布特征。為了進一步研究肝臟內皮細胞亞群支持肝臟再生的機制，本研究將肝臟內皮細胞分成5個帶狀分布細胞亞群，包括：中心區肝血管內皮(PC-LVECs)，中心區、小葉中部和門靜脈周肝竇內皮(PC-LSECs, mid-LSECs, PP-LSECs)，門靜脈周肝血管內皮(PP- LVECs)（圖5A5B5C）。并進一步通過空間轉錄組數據集驗證了肝臟內皮細胞的帶狀空間分布模式（圖S2J）。 Figure 5.肝臟內皮細胞在再生過程中出現帶狀分布特征 六、髓系免疫細胞亞型在再生過程中的動態變化 髓系細胞同樣在急性肝損傷后的再生過程中發揮著重要作用。本研究鑒定了10種不同的髓系免疫細胞類型，其中單核細胞比例在24小時達到峰值，而巨噬細胞在48小時達到峰值，提示該巨噬細胞分化來源于單核細胞。Kupffer細胞和單核細胞在所有時間點都形成不同的細胞亞群，表明急性肝損傷過程死亡的Kupffer細胞是通過存活的Kupffer細胞的增殖而被替代，而不是來源于單核細胞（圖6A6B6C）。 在激活的Kupffer細胞中上調最多的基因是Mmp12（編碼彈性蛋白酶基質金屬肽酶12的基因），Mmp12在24小時的表達水平是對照組的637倍，值得注意的是，Mmp12在巨噬細胞中也表現出上調的情況（圖6D）。當使用smFISH對MMP12的表達進行成像時，發現它在位于損傷區域的髓系細胞中表達（圖6E）。 Figure 6. 髓系免疫細胞亞型在再生過程中的動態變化
研究總結
肝臟組織再生可通過多種細胞類型精準的協調來實現。本研究利用單細胞分析手段研究了小鼠肝臟急性損傷后再生過程的細胞時空動態調控過程。發現肝細胞在肝小葉內增殖，產生有絲分裂壓力，使壞死的中心區迅速再生。位于再生界面的部分肝細胞會在重新編程到中心周圍狀態過程中，短暫上調胚胎特異性基因。而空間帶狀分布的內皮細胞、肝星狀細胞（HSC）和巨噬細胞群體在免疫募集、增殖和基質重塑中存在差異。其中可觀察到大量的暫時性骨髓細胞浸潤，但淋巴細胞豐度與抗原呈遞能力整體都呈現下降趨勢。本研究促進了人類理解肝再生過程的區域性協調過程（圖7）。 Figure 7. APAP誘導的肝損傷和再生過程總結
