2021-01-04
抗生素耐藥性及其在全球范圍內的傳播已成為國際關注的熱點。由于抗生素在醫療以及養殖業中的大量使用，增加了抗生素抗性基因（ARGs）在環境中的豐度和多樣性，加速了抗性基因在環境中的傳播。ARGs已成為一種新型的環境污染物，人們逐漸認識到ARGs在環境中的持久性殘留、傳播和擴散比抗生素本身的危害性還要大。因此，抗生素抗性基因的研究在環境科學領域也日益受到關注。
那么，如何對ARGs開展研究呢？宏基因組、宏轉錄組測序或許是較直接的研究方法，我們可以通過測序挖掘群落中微生物攜帶的各類抗性基因的信息（需要依靠抗性基因相關數據庫）。當然，宏組學研究分析比較復雜，花費也較大。因此，我們也可以采取更為“經濟”的辦法：一方面通過16S rRNA基因測序，對微生物群落的多樣性組成譜進行解析普查；另一方面，通過熒光定量PCR的檢測方法，對關注的ARGs進行定量分析。這樣，就能雙管齊下，還可以將菌群的組成分布特征，與ARGs的變化規律關聯起來哦！
最近，派森諾與華東師范大學、中國農業科學院合作，分別對食物廢棄物和牛糞堆肥中的微生物群落及其攜帶的ARGs進行了研究，采取的就是16S rRNA基因測序+熒光定量PCR檢測的方法，相關成果分別發表于環境微生態領域的權威期刊《Environment International》（影響因子：7.577）和《Bioresource Technology》（影響因子：7.539）上，可謂ARGs研究的典型范例！
項目文章①
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412020319681
研究目的：
ARGs在食物廢棄物中大量存在，但是目前對于ARGs在食物廢棄及其后續的工業化處理過程中的傳播擴散方式和影響路徑仍了解有限。本研究對兩類主要的食物廢棄物處理系統——好氧發酵（AF）和厭氧發酵（AcoD）系統中，ARGs的變化規律進行了分析。
研究方法：
本研究對10種ARGs（包括多重耐藥性（MDR）基因mexF、磺胺類抗性（sulR）基因sul1、四環素類抗性（tetR）基因tetQ、氨基糖甙類抗性（AgyR）基因aadA和strB、大環內酯類抗性（MLsR）基因mefA和ermB、Beta內酰胺類抗性（blaR）基因blaCTX-M、blaTEM和blaOXA）、2類整合子（I類整合子intl1和II類整合子intl2）以及16S rRNA基因分別進行了熒光定量PCR檢測，并通過高通量測序對微生物群落進行了解析。
測序平臺：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序區域：微生物組細菌16S rRNA基因V3-V4區
研究結果：
分析結果表明，食物廢棄物在處理前后，ARGs和整合子的相對豐度都顯著增加。在檢測的ARGs中，ermB和strB的豐度達到52.58~95.28%，是最主要的類群。Mantel檢驗還發現，I類和II類整合子（intl1和intl2）的豐度變化與ARGs顯著正相關（r = 0.24，p < 0.05），表明整合子在食物廢棄物處理過程中，對ARGs的豐度變化具有重要影響。本研究還通過RDA冗余分析，發現在處理前的食物廢棄物原料中，blaOXA、strB和blaTEM可能主要來源于潛在細菌宿主Firmicutes（96.55–99.77%）；但在AF處理系統中，blaCTX-M和mefA更多地在潛在細菌宿主Proteobacteria（17.12–49.82%)）中富集，而在AcoD中，ermB、sul1、aadA和tetQ則主要在Bacteroidetes（27.43–43.71%）中富集。總體而言，檢測的10個ARGs在用AcoD處理時，富集效果更為顯著（高達66.88 ± 87.34倍），且AcoD處理過程中會加入污泥（污泥往往含有更高的抗生素水平），因此厭氧發酵過程中微生物群落和ARGs的變化機制值得進一步關注。
AF和AcoD系統處理前后，食物廢棄物中ARGs的豐度變化
AF和AcoD系統處理前后，食物廢棄物中微生物群落在門和科水平的組成變化
ARGs和整合子的豐度變化具有顯著相關性
RDA冗余分析ARGs和微生物組門水平變化的關聯
總結：
本研究將有助于我們加深對ARGs在食物廢棄物處理過程中變化模式的理解，為今后進一步提升食物廢棄物的處理效率和控制ARGs水平奠定基礎。
項目文章②
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0960852420316771
研究目的：
動物糞便中含有豐富的ARGs，但目前的堆肥處理技術尚不足以有效控制ARGs的水平。本研究通過溫度控制的方法，通過添加抗生素磺胺甲惡唑（SMX），檢測該處理方法對于ARGs水平的控制效果。
研究方法：
本研究通過添加不同劑量的SMX抗生素，對牛糞堆肥進行處理，并在處理的不同階段對溫度進行控制（處理45天后達到保藏期）：
本研究對磺胺類抗性（SR）基因（sul1、sul2、drfA1、drfA7和sulA）、intI1以及16S rRNA基因進行了熒光定量PCR檢測，并通過高通量測序對微生物群落進行了解析。
測序平臺：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序區域：微生物組細菌16S rRNA基因V3-V4區
研究結果：
4種處理結果表明，添加的抗生素SMX濃度對于溫度、水含量、碳氮比、電導率（EC）和pH無顯著影響（p > 0.05），但ARGs在最初10天的嗜溫期豐度顯著降低，隨后sul1和sul2在處理30天后豐度明顯升高。在堆肥處理后期，ARGs彼此之間的豐度變化更具相關性。值得注意的是，堆肥本身的性質（如溫度的變化），對于微生物群落具有顯著影響，進而體現出對ARGs豐度的富集作用。
堆肥處理過程中，微生物群落在門和屬水平的組成變化
堆肥處理過程中，ARGs的豐度變化
堆肥處理10天（A）、30天（B）、45天（C）時，ARGs、intI1和16S rRNA基因豐度關聯性的變化
偏最小二乘法路徑分析（PLS path analysis）評估ARGs、MGEs（可移動遺傳元件）、堆肥溫度、堆肥理化性質（電導率、pH、濕度和碳氮比）及其與微生物群落之間的作用關系
總結：
本研究為進一步提升堆肥處理工藝并完善其評價標準、以及控制堆肥中的抗生素抗性水平提供了參考。
以上研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進一步討論，歡迎討論區留言或者發郵件給我們喲（郵箱地址：[email protected]）！
