2020-08-12
RNA甲基化作為當(dāng)下“國自然”研究熱點，熱度只增不減。小派君還會持續(xù)給大家?guī)砀嘀R與研究思路，還沒有關(guān)注我們的小可愛們來波關(guān)注吧~
m6A（RNA甲基化）檢測方法，你選對了嗎？（點擊查看）
今天我們要給大家分享的是RNA甲基化的研究思路，帶大家更好的理解RNA甲基化測序（MeRIP-seq）技術(shù)的應(yīng)用。
在介紹研究思路之前，我們要知道m(xù)6A甲基化過程中涉及的這3類重要的酶：
1、Writers，甲基化酶，催化m6A甲基化的發(fā)生；
2、Erasers，去甲基化酶：去除m6A甲基化的修飾；
3、Readers，m6A識別蛋白，識別m6A修飾位點。m6A修飾被不同的reader識別會發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，如影響mRNA的剪接、出核、定位、翻譯和穩(wěn)定性等。
一、構(gòu)建m6A轉(zhuǎn)錄組修飾譜
構(gòu)建m6A轉(zhuǎn)錄組修飾譜，通過MeRIP-Seq看整個轉(zhuǎn)錄組的m6A修飾情況，得到發(fā)生m6A修飾的基因以及m6A的修飾水平。也更適合多數(shù)非模式物種來做，以及在沒有條件開展較多生化實驗以及分子互作機(jī)制的時候選擇。如果覺得單一組學(xué)太單薄，可以做多組學(xué)整合研究，基于多組學(xué)數(shù)據(jù)尋找表面調(diào)控規(guī)律。
當(dāng)然，若不想看整個轉(zhuǎn)錄組的m6A修飾情況，可以做MeRIP-qPCR，針對目標(biāo)基因看m6A修飾水平；若只想看整體m6A水平變化，不看基因?qū)用娴模梢杂肈ot blot、LC-MSMS、Elisa等方法看整體修飾水平的變化。
參考文獻(xiàn)：
Jabs S, Biton A, Bécavin C, et al. Impact of the gut microbiota on the m6A epitranscriptome of mouse cecum and liver. Nat Commun. 2020;11(1):1344. Published 2020 Mar 12.
二、m6A甲基化與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析
MeRIP-Seq與RNA-Seq聯(lián)合分析，可以同時得到基因的m6A修飾水平與表達(dá)水平，在結(jié)果中可挖掘Writers的靶基因，并結(jié)合RIP實驗驗證。這兩個組學(xué)整合后的結(jié)果分5種情況：都上調(diào)、都下調(diào)、m6A水平上調(diào)但表達(dá)水平下調(diào)、m6A水平下調(diào)但表達(dá)水平上調(diào)、以及均無變化。由于不同reader會引起RNA的命運朝著不同方向改變，因此聯(lián)合分析的結(jié)果可以通過生化與實驗去驗證，挖掘分子機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：
Song T, Yang Y, Wei H, et al. Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and post-transcriptional regulation to promote adipogenic differentiation. Nucleic Acids Res. 2019;47(12):6130-6144.
三、關(guān)鍵酶與下游基因靶向關(guān)系驗證
通過RNA-pull-down與RIP等實驗，探索與目的基因特異性結(jié)合的蛋白。這可以用作RNA甲基化關(guān)鍵酶與基因之間互作關(guān)系的挖掘與驗證。由于目前已明確鑒定到了很多writers、erasers與reader蛋白，并且也明確了很多reader的功能，這樣的話，如果發(fā)生m6A修飾的目標(biāo)基因能被一個影響RNA穩(wěn)定性的蛋白結(jié)合，那么就可以做RNA穩(wěn)定性實驗來進(jìn)一步驗證我們的發(fā)現(xiàn)；如果發(fā)現(xiàn)m6A修飾的基因被影響翻譯效率的RNA結(jié)合，那么可以做WB等蛋白定量實驗來驗證。
參考文獻(xiàn)：
Li T, Hu P S, Zuo Z, et al. METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma[J]. Molecular Cancer, 2019, 18(1).
四、敲除/過表達(dá)RNA甲基化關(guān)鍵酶研究下游機(jī)制
該思路可用于RNA甲基化研究的第一步，通過敲除甲基化酶或者過表達(dá)去甲基化酶，觀察表型，以確認(rèn)某關(guān)鍵表型是否受RNA甲基化調(diào)控，若是，則開展RNA甲基化測序、轉(zhuǎn)錄組測序等，來研究其中m6A修飾的調(diào)控機(jī)制。該思路也可以在做完RNA甲基化之后作為進(jìn)一步的驗證手段，在獲得基因m6A修飾情況后，通過敲除或過表達(dá)readers，看reader的靶基因的命運，再進(jìn)一步觀察相應(yīng)表型。
參考文獻(xiàn)：
Lin X, Chai G, Wu Y, et al. RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail.[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).
五、m6A甲基化與翻譯組聯(lián)合分析
通過組學(xué)手段或者目標(biāo)基因/蛋白的定量手段獲得基因的表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平，再通過m6A修飾水平與翻譯組檢測技術(shù)，以及RIP實驗等，尋找基因的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平的背后機(jī)制。有部分reader在識別m6A修飾位點之后，會引起目標(biāo)RNA的穩(wěn)定性、降解、翻譯效率等問題。
參考文獻(xiàn)：
Vu L P, Pickering B F, Cheng Y, et al. The N6-methyladenosine (m6A)-forming enzyme METTL3 controls myeloid differentiation of normal hematopoietic and leukemia cells.[J]. Nature Medicine, 2017, 23(11): 1369-1376.
六、LncRNA甲基化介導(dǎo)的表型變化的分子機(jī)制研究
雖然大部分m6A修飾更多的集中在mRNA中，不過也有研究表明lncRNA上的m6A修飾也會影響lncRNA的命運，如對miRNA、蛋白的結(jié)合能力等，進(jìn)而調(diào)控不同通路來影響生物學(xué)表型。
參考文獻(xiàn)：
Zhang S, Zhao BS, Zhou A, et al. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell. 2017;31(4):591-606.e6.
