2024-08-17
近年來，空間轉錄組（ST）方法的開發和應用急劇增加。與標準的單細胞方法不同，ST保留了捕獲的轉錄組的空間背景，從而允許直接觀察細胞和它們在組織空間中的相互作用的排列。而目前市場上可用的空間轉錄組技術，其中商業化的空間技術主要受限于相對較高的成本、有限的分辨率以及高特異性捕獲等，非商業的空間技術又受限于較低的捕獲效率以及繁瑣的實驗操作等，且均還難以實現端對端在三維空間中生成并計算分析ST。 2024年6月德國柏林醫學系統生物學研究所在《Cell》上發表了一篇關于新的空間組學技術的文章（IF：45.5）：Open-ST：High-resolution spatial transcriptomics in 3D。主要介紹：作為一種成本效益高的方法，Open-ST結合了高分辨率和高效的轉錄組捕獲，以及廣泛的開源實驗資源和軟件，可以用于在二維和三維中無縫的數據加工和分析。（所有協議和軟件可在 https://rajewsky-lab.github.io/openst 上獲取）
整體工作流程 通過測序包含barcode（32nt）、測序接頭和聚(dT)區域的寡核苷酸來生成空間條形碼序列及其相關的（x和y）坐標；處理寡核苷酸以允許聚(A)轉錄本捕獲同時根據實驗設計選擇對測序芯片進行切割成所需大小（若選擇3mm*4mm，則可以切割成360個）；也能夠從相同的冷凍切片分析組織形態（H&E）和 ST；在處理樣本時，整體流程與常規ST技術相仿。蛋白酶和雜交緩沖液結合在一個溶液中，以促進組織的同時滲透和 RNA 捕獲，進而減少單鏈DNA和RNA分子之間的靜電排斥；利用qPCR檢測確定最佳的滲透條件，以實現最大的mRNA捕獲；在文庫制備過程中依據前期的qPCR結果，以確定最佳PCR循環次數；原始H&E圖像自動預處理，并使用微調的Cellpose模型將圖像分割成單個細胞；在核分割后，通過核邊界的徑向擴展增加了細胞質上下文；使用第一次測序運行中的條形碼坐標以及處理后的轉錄組數據，使用Spacemake在組織空間中映射。Open-ST能夠無偏差地適應具有不同細胞大小和密度的組織，并自動從下游分析中排除沒有細胞的區域。同時可以在單細胞水平上進行數據分析，并與成像數據集成。最后，鑒于高效的轉錄捕獲和集成的計算流程，Open-ST適用于任何組織的三維空間重建（圖1-2）。
主要優勢及其應用 高效且穩定地捕獲轉錄本 Open-ST在多種組織（胚胎小鼠頭部、成年小鼠海馬體、人類原發性腫瘤）應用中，均展現了高比例的獨特基因組映射轉錄本（65%-78%），并且只有一小部分讀段由核糖體RNA 組成（2.5%-15.3%）。在每個細胞中平均捕獲到621個基因和880個UMIs，其中42%的高質量細胞（所有分割細胞的 32%）含有超過 1,000個轉錄本。所有捕獲的轉錄本中，82% 被發現在分割的細胞內。在整個數據集中，10,000個基因占到了捕獲的轉錄組信息的95%。為評估了Open-ST數據的庫復雜性，與現有的基于測序的ST方法進行了比較發現在相同測序深度的捕獲效率方面始終優于其他空間技術，除了Visium顯示出相當的性能（圖3）。 圖3 高精度捕獲局部標記基因 Open-ST能夠高精度捕獲組織局部的標記基因。為了驗證其性能，選取了E13小鼠頭部（文獻已報道）進行測試。基于Open-ST數據結果大致聚類反映了胚胎小鼠頭部的主要解剖區域并共鑒定了三個神經元簇，分別以Tbr1、Lhx9或Nefl 表達為特征。進一步的簇包括成纖維細胞（表達膠原蛋白）、軟骨細胞、肌細胞、間充質細胞和內皮細胞。同時初步聚類揭示了一組沒有可識別標記的細胞。在這些細胞上，我們進行了子聚類，并鑒定了我們稱之為神經嵴、顱面發育、肌肉骨骼發育、免疫和早期血管的細胞群。Open-ST捕獲豐富的轉錄組信息的能力，進而能夠對前腦、中腦和后腦的分割細胞進行更精細的聚類。前腦中細胞類型的多樣性和空間分布與從單一細胞參考圖譜中整合和轉移細胞類型標簽所獲得的結果相似。此外，為了調查捕獲定位，我們將轉錄本在H&E上繪制成虛擬原位雜交，強度與基因表達相關，結果與Allen發展中鼠腦圖譜中的染色體原位雜交（ISH）染色高度一致。同時通過局部捕獲也反映明顯的核質結構，在研究成年小鼠海馬體半球的冠狀切片發現，通過細胞分割掩模上可視化核保留的Malat1和線粒體編碼轉錄本計數，顯示出了準確的轉錄本定位。Malat1在核中顯著富集，而線粒體轉錄本在質室中富集（圖4）。 圖4 空間復雜細胞類型捕獲能力 Open-ST具有較好的空間復雜細胞類型的捕獲能力。通過對一個原發性頭頸鱗狀細胞癌腫瘤以及同一患者的健康和轉移性淋巴結進行了空間測序。在所有三個數據集中，我們都鑒定出了對應于腫瘤、基質和免疫群體轉錄多樣性的標記，其空間鄰近富集與病理學家在 H&E圖像中獨立概述的注釋相匹配。例如，“角蛋白珍珠”(KPs)，作為鱗狀細胞癌的特征，出現在原發性和轉移性腫瘤組織中；腫瘤細胞和癌癥相關的巨噬細胞（CAMs）在兩種原發性和轉移性組織中都表達了FABP5；癌癥相關的成纖維細胞（CAFs）（COL1A1+）在兩種腫瘤組織的微環境中被鑒定出來，其中一部分在轉移性腫瘤中表達了高水平的ACTA2；內皮細胞（PECAM1、ACTA2）在原發性腫瘤中被鑒定出來，而淋巴結中的內皮細胞表達了 ACKR1；在轉移性淋巴結內，CXCL8在CAM群體中表達，與腫瘤和KP簇共定位等。最后還檢測到多個生發中心。這些生發中心表現出局部表達FDSCP，一種由生發中心樹突細胞分泌的蛋白質以及IGHM。此外，根據IGHG3或IGHA1的強表達，將兩個簇分類為免疫球蛋白IgG或 IgA漿細胞。無偏細胞類型標記特征鑒定了免疫和基質細胞在脂肪細胞群體內（FABP4、ADIPOQ、PLIN1、SORBS1、CIDEC 和 SIK2）（圖5）。 圖5 揭示原發性和轉移性頭頸鱗狀細胞癌中的空間受限異質性 Open-ST揭示了在原發性腫瘤中緊密相鄰的多種腫瘤細胞狀態，它們的空間組織緊密遵循細胞-細胞通訊熱點的分布。通過整合和聚類兩個樣本（發性頭頸鱗狀細胞癌和轉移性淋巴結中腫瘤）中的42,132個腫瘤細胞，我們鑒定出了10種不同的轉錄組狀態（T1-T10），為它們的異質性、空間分布和基質相互作用提供了詳細的圖譜。腫瘤轉錄組狀態在原發性和轉移性樣本中顯示出不同的空間組織模式。特別是在原發性腫瘤中，腫瘤狀態被組織成連續的空間域，每個域普遍對應于特定的狀態。相反，在轉移性組織中，腫瘤狀態看起來更加混合，沒有明確定義的邊界。基于它們的表達水平，通過非負矩陣分解實現，得到了四個非負因子，跨越了原發性腫瘤和轉移，每個因子具有獨特的相互作用特征：炎癥（F1）、基質硬度（F2）、粘附（F3）和細胞外基質（ECM）重塑（F4）。這些因子在原發性腫瘤中顯示出比在轉移性中更高的空間組織程度，遵循更加混合的腫瘤狀態組織。不同的腫瘤狀態被限制在特定的細胞-細胞相互作用熱點（圖6）。 圖6 VS Xenium In Situ Open-ST產生的空間基因表達和轉錄組簇與Xenium結果基本一致。使用相同的人類腫瘤樣本，將Open-ST與基于成像的ST方法（Xenium In Situ，10X Genomics）進行了比較發現，兩種方法都在兩個樣本中解析出相似的多樣性和空間分布的細胞類型，盡管它們在切片軸上的間隔超過100um。在兩種模式下獨立注釋為相同身份的簇顯示出基因表達大體一致。采用相似的分割方法，兩種方法每平方毫米產生了大約5200-5500個細胞。在Open-ST中，被細胞捕獲的總轉錄本比例比Xenium低約20%。盡管存在這些差異，兩種方法在整個樣本中所有基因的總表達上高度相關。此外，無論是否進行子集化，Open-ST都能產生相似的細胞類型的分類和空間分布（圖7）。 圖7 三維虛擬組織構建以及探索三維其他生物學信息 Open-ST能夠在連續切片中穩健地捕獲轉錄本，非常適合高通量研究和組織的三維轉錄組重建。通過處理一個人轉移性淋巴結，獲得了跨越350 um組織深度的10 um切片，其中19個切片用Open-ST進行分析、11個切片僅進行 H&E 染色、1個切片進行免疫熒光染色以及5個切片保留用于驗證。實驗結果，共獲得了超過100萬個細胞的基因表達譜，每個分割的細胞中基因（313-624）和UMIs（438-1008）的捕獲中位數都很高，利用STIM和 Visualization Toolkit，將連續切片對齊，重建并可視化三維虛擬組織塊并通過平滑等值面渲染空間映射的UMI計數表明了在腫瘤區域的可重復捕獲效率（圖8）。 圖8 Open-ST能夠通過體積渲染和平滑表示來增強清晰度，進而在三維中探索基因表達。例如，我們通過特定標記基因的表達在三維中可視化了淋巴結的淋巴樣、轉移性腫瘤和基質組織區域的劃分。重建的組織可以用于全面的探索性三維分析，同時查詢轉錄組和成像模態。像體積裁剪和平面裁剪這樣的渲染技術可以用來探索任何方向上的基因表達，而不受切片平面的限制。例如，我們可視化了ACKR1（一種局限于后毛細血管靜脈的內皮標記）的基因表達連續性，通過在三維虛擬組織塊中使用平面裁剪，可以跨 z 軸跟蹤后毛細血管靜脈，并揭示其表達是如何局限于轉移性淋巴結的免疫區域，形成網絡狀結構。此外，我們檢查了在初始切片中看似與主要腫瘤塊斷開的角化珠（KP），我們的三維重建揭示了它在后續切片中與腫瘤塊的連續性，證明了在成像和轉錄組模態中的連續性。此外，三維重建的力量遠遠超出了對細胞類型和組織結構的研究；例如，檢查三維中細胞具有高膽固醇生物合成基因集活性的空間組織（圖9）。
結 論 Open-ST，是一套實驗和計算工具的框架，用于在亞細胞分辨率下高效捕獲和分析組織空間中的轉錄本， 在空間測序結構復雜的臨床相關人類原發組織方面的具有廣泛適用性。在數據處理方面，使用Open-ST計算工具包可以應用于其他實驗設置和處理過的樣本。此外，模塊化方法允許在必要時使用替代工具和算法進行任何（預）處理步驟。總的來說，在提供了詳細的實驗資源和開源計算工具情況下，Open-ST有望成為后期科研用戶的強有力的工具以及ST分析的標桿。
