2024-08-13
代謝組學樣本的收集是整個研究過程中的關鍵環節，樣本的收集和處理直接影響代謝物的穩定性和檢測的準確性，影響著研究的有效性和可靠性。合理的樣本選擇和收集策略能夠確保所研究的代謝物反映整個生物體或特定組織的真實狀態，提高數據的可靠性，增強研究結果的普遍適用性。代謝組學的研究樣本主要有動物或臨床血樣（血清、血漿）、尿液、糞便、腸道微生物、組織、細胞、土壤、植物器官、微生物細菌、真菌及其發酵液等等。本文匯總了代謝組學樣本收集的基本原則、各種樣本的取樣方法及科研工作者常遇見的問題，供大家參考和查閱。
樣本收集原則 無菌操作：手術器械、容器等材料必須保持潔凈，避免污染。 一致性：取樣人員盡可能使每組樣本在取材部位、組織塊大小、時間及處理條件等方面保持一致。 迅速性：保證質量的前提下在樣本采集、制備、凍存的過程中提高速度，盡可能減少操作時間，確保樣本的真實狀態。 除雜：去除與實驗無關的雜質，如動物組織去血、植物組織去除泥土等污染物、菌體及細胞去除培養基等，推薦使用PBS緩沖液或者生理鹽水，吸水紙吸干殘留液體。 全程低溫：樣本離體后，如有分離步驟可在4℃或冰上進行，分離好的樣本立即置于液氮中速凍，-80℃保存，干冰運輸。 分裝：提前規劃好實驗用量，避免反復凍融。 樣本足量：應檢測要求、生物信息學分析要求及項目結果準確性等，各個類型樣本的送樣量及生物學重復最好大于其對應的建議量。 標記清晰：確保樣品管質量可靠、避免標簽脫離或標記消融等，以免混淆樣本。
不同樣本收集流程 一、血液樣本（血漿/血清） 1.血漿 樣本收集步驟： 用抗凝管（代謝組學研究建議 EDTA，不推薦檸檬酸鈉）采集血液，采血后立即輕輕顛倒混勻采血管 5-10 次，以確保抗凝劑發揮作用；采血后需在30min內盡快離心分離出血漿（若不能盡快離心，采集的血液需放在4℃冰箱保存，并必須在4h內完成離心及分裝），4℃條件下3000 rpm離心10 min-15 min，吸取適量上清液（即血漿）置于合適的已編號的EP管中；如此重復分裝成多管血清以避免反復凍融，盡快將血漿保存于-80℃冰箱中。 2.血清 樣本收集步驟： 用不含抗凝劑的樣本收集管采集血樣，或將采好血樣的采血管室溫靜置（注意：不能振搖采血管）；靜置30 min-60 min使其凝結后，再將采血管放入冷凍離心機內，4℃條件下3000 rpm，離心10 min-15 min，吸取上清液（即血清）分裝于合適的已編號的EP管中；如此重復分裝成多管血清以避免反復凍融，盡快將血清保存于-80℃冰箱中。 注意事項： （1）血漿參考產率≈50%，例如1mL全血大約能得0.5mL血漿。 （2）血清參考產率≈30%~50%，例如1mL全血大約能得0.3~0.5mL血清。 （3）采集到的血清為黃色透明液體、血漿為淡黃色半透明液體，如果發現樣本中是紅色，說明已經發生了溶血現象，樣本需重新制備。 二、其他體液樣本（尿液/唾液/痰液） 1.尿液 樣本收集步驟： 取晨起中段尿（臨床）或晨間 1h 尿（動物），3000rpm，4°C 離心 10min，將澄清尿液分裝到離心管中，做好標記后，液氮速凍15min，于-80℃下保存。 注意事項： （1）動物1小時尿量不夠，可分多次收集，如果需要收取24h尿液，請使用帶有低溫裝置的代謝籠收集，并及時凍存樣本。 （2）不推薦使用抗菌劑，使用無菌的采集容器，確保樣本不受外部環境的污染。 （3）受試者應避免在采樣前夜食用可能干擾代謝分析的食物或飲料（如酒精、咖啡等）。 2.唾液 樣本收集步驟： 唾液樣本需在靜息狀態下進行收集，在收集唾液樣本前，請用飲用水將口腔內的雜物洗漱干凈。確認唾液采集管的外包裝完好；檢查唾液采集管中的保存液，確認無漏液，確認保存液中沒有沉淀析出，低溫凍存寄送。 注意事項： （1）收集前至少2小時避免禁食禁煙禁水等（盡量不要接受外界刺激，建議晨起收集）。 （2）為保證收集的唾液中富有足夠量的細胞，建議漱口時間為收集唾液樣本的前30分鐘。 3.痰液 樣本收集步驟： 采樣前12h禁食，清晨痰量多，可作為取樣時間；采集前應進行漱口，以除去口腔中細菌；深吸氣后用力咳出1－2口痰于廣口無菌瓶中，痰量極少可用45℃ 10%氯化鈉溶液霧化吸入導痰；添加質量體積為0.5/1000（w/v）的疊氮化鈉，用注射器將痰液來回抽提并打出，使得痰液混勻；-80℃凍存，足量干冰寄送。 三、人/動物組織樣本 適用于腦、心臟、肝臟、腎臟、肌肉、皮膚、血管、軟骨等。 樣本收集步驟： 根據具體實驗設計準確切除所需組織，迅速剝去非必需的脂肪和結締組織等；用預冷的PBS緩沖液或生理鹽水清洗干凈，以去除血液殘留和污物；用干凈的無塵吸水紙吸干水分，根據實驗設計將組織分裝待用；管子上做好標記后放入液氮中冷凍處理至少 15min，-80℃凍存，足量干冰寄送。 四、糞便與腸道內容物 1.人糞便 樣本收集步驟： 采樣時間為早上和中午較好，采集前先排尿，將糞便于清潔干燥的容器中，采用無菌小勺、手術刀或糞便取樣器等工具，挖取排泄中后部的內側糞便，混合均勻后分裝為多份。稱重記錄，采集量需達到樣本量要求。可每例樣本準備多管備份，液氮速凍后-80℃保存。 2.小鼠糞便 樣本收集步驟： 待測的小鼠排便后，立即用滅菌的鑷子夾取；收集小鼠糞便6-8粒，轉入凍存管；為避免反復凍融，樣本可用無菌棒混合均勻后進行多管分裝；-80℃冰箱凍存。寄樣需足量干冰。 注意事項： （1）糞便樣本盡量不要接觸到尿液，避免多樣本交叉污染，且尿液中含有大量尿素，會干擾后續糞便樣本檢測。 （2）人糞便樣本提供者在取樣的近三個月內不可接受抗生素治療。 3.腸道內容物 樣本收集步驟： 使用無菌的解剖刀，盡量在無菌狀態下取出整個腸道，將實驗所需的腸段的內容物切下，將內容物取出放置在無菌離心管中，建議分裝保存，便于后續實驗需求，低溫保存運輸；若是無法立即抽提，建議將樣本先置于液氮中冷凍4小時以上，保證冷凍充分再轉移到-80℃保存。 五、土壤 樣本收集步驟： 取樣區域一般是根據實驗設計進行選擇，建議選取具有代表性的土壤；采樣時使用的所有工具、采集袋或其他物品均要使用已滅菌的；若野外沒有合適的條件進行滅菌處理，可以使用采集的土壤對取樣工具進行擦拭，盡量去除干擾；采集時一般選取5-10 cm處土壤，去除雜質，將一定量的土壤進行分裝標記，密封后立即低溫保存。 六、細 胞 1.貼壁細胞 樣本收集步驟： 從培養箱中取出用于計數的細胞樣本，去除培養基后用PBS洗一遍，去除PBS，之后加胰蛋白酶消化后計數，得到細胞數目，接下來開始處理正式實驗用的樣本；去除培養基，加PBS洗2-3遍后徹底去除PBS。 方法1：加入1 mL預冷的PBS溶液，快速用細胞刮將細胞刮下來，收集到離心管中，低速離心1 min，棄去上清，收集細胞沉淀于2 mL進口離心管中，液氮速凍15 min，-80℃保存，足量干冰運輸。 方法2：加入1 mL預冷的LC-MS級別的甲醇/乙腈/水（2:2:1，v/v/v，代謝組）快速用細胞刮將細胞刮下來，收集到進口離心管中，加封口膜密封好，送樣前置于-80°C保存；足量干冰運輸。 注意事項： 對于貼壁細胞的代謝研究，不建議使用胰蛋白酶消化。 2.懸浮細胞 樣本收集步驟： 離心去除培養基，PBS洗2-3遍后離心去除PBS，液氮速凍后置于-80°C暫存。 七、植物組織 1.葉片、莖、花 樣本收集步驟： 取整片葉片/一段莖/一朵花，用錫箔紙包裹并標記后，迅速放入液氮中冷凍處理至少15min。取出后迅速放入自封袋中(每組一袋)，在自封袋中放入標簽紙注明樣本信息。迅速放入-80°C凍存，干冰寄送。 注意事項： （1）采集葉片樣本時，最好在中午光照好的時間收集。 （2）要根據實驗設計，采集樣本時保持樣本一致性，尤其是同一組樣本（如顏色、衰老程度、葉脈占比、光照、位置等）。 2.根 樣本收集步驟： 取整株植物的根部，迅速用1×PBS漂洗掉根上的泥土。根據具體實驗設計取植株根特定的部位，樣本裝入離心管中。標號后迅速放入液氮中冷凍處理至少15 min。-80 °C凍存，干冰寄送。 注意事項： （1）PBS漂洗要快。 （2）由于根部組織特別脆弱，被擠壓后會變成漿糊狀，所以推薦保存至離心管中，而不是錫箔紙包裹。 （3）植物各類組織樣本建議都使用超純水進行漂洗完之后，再研磨分裝凍存，防止因種植過程中施加的一些肥料、農藥等含有表面活性劑或其他雜質，對后續實驗造成影響。 3.果實、種子 樣本收集步驟： （1）對于含多汁、塊頭較大的果實（番茄、西瓜、蘋果等）需要先用鋒利的刀分割成“均勻”合適的小塊（≈200 mg/樣本）分裝至2 mL離心管中，標號后迅速放入液氮中冷凍處理。 （2）對于細小的顆粒種子（擬南芥種子、谷物種子等），可以先將同一組的植株種子混勻后再分裝（≈200 mg/樣本）至離心管中，標號后迅速放入液氮中冷凍處理。 （3）對于要求對整個果實進行提取的（整粒葡萄等），需要把果實裝在50 mL離心管中/自封袋中，標號后迅速放入液氮中冷凍處理。 注意事項： （1）對多汁的果實進行取樣很難保持均一性（如番茄、皮、果肉、果瓤、籽的占比），建議將整個果實進行研磨、凍干，對粉末進行稱重分裝。 （2）不推薦用錫箔紙包裹。 八、微生物樣本 1.細菌/酵母菌體 樣本收集步驟： 取生長到一定程度的菌液，測OD值，用培養基將各個樣本的OD值調到一樣，保證取樣的菌體數目均一。取1個15 mL離心管，稱量并記錄離心管的重量a。取5 mL的等量菌液加到上述離心管中，離心后棄培養基，再用生理鹽水或者PBS洗2-3遍，洗去殘留培養基，離心去上清，保留菌體沉淀，用槍頭徹底去除液體，再次稱量并記錄重量b，用b-a得到菌體濕重，看是否達到送樣量要求， 如果不夠的話繼續取菌液離心直到達到送樣量要求。記錄達到送樣量要求所需要的菌液體積。對剩下所有菌液樣本都取上述記錄的體積，離心去除培養基，生理鹽水或者PBS洗2-3遍，用槍頭徹底去除上清。菌體沉淀連同離心管一起放進液氮中速凍，之后置于-80℃冰箱中保存。 2.固體真菌 樣本收集步驟： 稱量固體真菌樣本于離心管中，達到送樣量要求。菌體連同離心管一起放進液氮中速凍，之后置于-80℃冰箱中保存。
常見問題解答 1、為什么要避免反復凍融？ 代謝組學樣品應盡量避免反復凍融，這是因為環境溫度及變化均會對生物體內的小分子代謝物產生影響[1]。因此，我們建議在存儲前有計劃地將樣品提前分裝好，盡量避免反復凍融。 2、存儲條件對代謝物的影響？ 樣品長期存儲于液氮中是最理想的存儲方式，但是需要不斷補充液氮，操作成本高。實驗室中最常見的存儲方式是-20℃和-80℃冰箱。研究表明，經過長達6個月的存儲以后，除部分代謝物（如蛋氨酸、B族維生素、DHA和EPA）在-20℃下存儲3個月以上會發生顯著降解，-20℃和-80℃存儲的樣品整體代謝輪廓沒有明顯差異，且和收集當天較為類似[2-4]。因此，推薦將樣品存儲于-80℃冰箱，并盡快送檢。 3、選擇血清還是血漿？ 全血的穩定性差，存在異質性，所以一般檢測中避免使用全血而選用血漿或血清。血清和血漿樣本都被廣泛用于代謝組學研究，整體而言，血清和血漿的代謝物種類差異不大，但是多數代謝物在兩種樣本中濃度差異較大[5-6]。因此，對于同一個研究項目而言，我們選擇同一類型的血液樣本（血清或血漿）。 4、血漿或血清溶血的影響？如何避免溶血？ 溶血可以引起苯丙氨酸、鳥氨酸、檸檬酸、琥珀酸、磷脂以及鞘脂等多種代謝物的改變[8]。為了避免溶血，在制備血清血漿樣本時應注意離心速度和時間，避免轉速過高；在采集血液過程中避免劇烈晃動；每管加入蛋白酶抑制劑可以有效地保護蛋白質完整性、提高實驗數據的準確性和可靠性，并且有助于延長樣品的保存時間。 5、如何選擇抗凝劑？ 常見的抗凝劑有三種：EDTA、檸檬酸、肝素鹽。其中，檸檬酸和EDTA是通過鈣離子鰲合作用而抗凝，而肝素是通過激活抗凝血酶，抑制凝血因子而抗凝。檸檬酸是TCA 循環中的重要物質，使用檸檬酸鈉抗凝劑會引入外源污染；EDTA在NMR上會產生很強的噪音信號[9]。而肝素鹽抗凝管會在液質上產生嚴重的干擾信號[5,8]。若選擇質譜作為代謝組學檢測平臺，我們推薦EDTA作為血漿抗凝劑。 6、為什么尿液收集不推薦加抗菌劑？ 由于尿液中細菌生長迅速，有些研究會在尿液中添加如硼酸和疊氮化鈉等抑菌劑保護尿液樣本不被污染。但這些外來化學試劑的添加不可避免地會對尿液中的代謝物產生不利影響。已有研究表明，尿液樣品在低于-25℃條件下儲存時，添加抑菌劑和不加抑菌劑，樣品的代謝輪廓沒有差異[10-11]。因此，我們不建議在尿液樣品中添加如疊氮化鈉等抑菌劑。 7、不同部位的糞便樣本有無影響？ 有影響，且在不同個體之間差異和影響不一致。因此，建議對于單個樣本量大的糞便樣本，在低溫儲存前用無菌棒混勻取適合的量儲存。而單個樣本量少的樣本，可以整個儲存，后續檢測時再混勻。 8、為什么對于貼壁細胞的代謝研究不建議使用胰蛋白酶消化？ 胰蛋白酶會造成細胞膜發生透化，促使代謝物滲漏出細胞，流向細胞外部，導致細胞內代謝物耗盡的“代謝物滲漏”現象。同時，胰蛋白酶消化還會刺激脂肪酸和能量利用相關的代謝物豐度信號劇增，造成胰蛋白酶化過程中出現代謝物的假陽性差異。可采用細胞刮棒的物理方式消化和解離細胞，盡量減少胞內代謝物的損失，獲取更多的代謝物信息。
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